基因顯微鏡——單細胞基因組測序

2009 年，以色列魏茲曼科學研究所 (Weizmann Institute of Science)的基因 組研究員和免疫學家 Ido Amit 碰到了一個棘 手的問題。當他和同事在研究基因調控時，發 現追蹤多個不同種類的免疫細胞之間的遺傳差 異是一件異常困難的事情，同時常規的基於細 胞群體的測序能夠提供的信息非常有限。為了 更深入地研究這個問題，他需要一些全新的技 術: 單細胞水平的基因測序技術。

自 21 世紀中期首個商業性質的高通量 (也 稱為下一代測序) 測序器進入市場后，基因 組測序的成本不斷下降。隨之而來的是，整 個行業發生了變化，這為個性化醫學和法醫 學等重要領域開闢了可行的途徑。斯坦福大學 (Stanford University) 的生物工程師 Stephen Quake 指出，高通量測序是非常寶貴 的、高度自動化的、特別快速的複合視圖，不 是具體的單個視圖。

此外，正如 Quake 所說，高通量基因組測 序依賴大塊組織分析。高通量測序中，你研磨 整個組織，把不同的細胞類型混合在一起，然 后你會得到一些平均值。對於研究整個生物體 的基因組來說，這樣是沒有問題的，但這樣做 會很容易模糊通常較為顯著的多樣性——異質 性——不同細胞類型之間的遺傳序列。

單細胞測序方法的早期開發者 Quake 表示，單細胞基因組測序與此不同。在單細胞基 因組學中，我們專註的是每個獨立的細胞。因 此，該技術允許科學家探索生物和系統的遺傳 多樣性，並將複雜的生物學分解成單獨的遺傳 數據集。

這種方法對於 Amit 在免疫系統研究中試圖解答的問題至關重要。免疫系統非常複雜，其 中多個類型的細胞都在生物過程中扮演重要角 色。Amit 等人是構建單細胞測序技術的少數 群體之一。他們的工作讓科學家能夠深入挖 掘，進一步了解遺傳水平上個別細胞之間的微 妙差異。簡而言之，科學家現在有一個遺傳顯 微鏡，解析度可以達到單細胞水平。

Amit 強調，這種新的『顯微鏡』在免疫學 領域開闢了許多以前想都不敢想的基礎研究和 生物醫學研究。我們現在可以在複雜的細胞群 體，如免疫 - 腫瘤生態系統中研究高解析度數 據驅動模型，以確定特定的細胞類型和通路 了。

但單細胞測序也存在諸多問題。相比傳統 方法，單細胞基因組學在技術和分析上更具挑 戰性。科學家需要從一個細胞中提取核酸，然 后數百萬次化學放大這個樣本，同時保留原有 的遺傳內容。運算和分析部分也更具挑戰性， 因為該技術迄今只能捕獲單個細胞的轉錄物質 中的一小部分，因此我們必須通過測序和複雜 的計算方法來不斷改進這種技術。

田納西州孟菲斯州 St Jude 兒童研究醫院 (St Jude Children's Research Hospital) 的腫瘤學家 Charles Gawad 指出，這項技術的 潛力遠遠超過了它面臨的挑戰。目前該方法的 應用越來越廣泛，它通過人體細胞圖譜計劃 (Human Cell Atlas)(見: 破譯人體每個 細胞的類型和特性)等幫助科學家們深入了解 個體細胞的性質和特徵，並幫助研究人員研究 包含多種細胞類型的疾病和系統。值得一提的是，在異質性起重要作用的疾病中，這種單細 胞測序尤其有用。

對此，Gawad 指出，腫瘤正是這樣一種疾 病，適用這種技術。我們並不知道腫瘤的異質 性有多大; 同時我們也不知道確診時，腫瘤中 有多少細胞已經存在耐藥性。

他的實驗室計劃通過單細胞測序來研究腫 瘤的遺傳多樣性。通過這樣做，Gawad 打算重 新定義腫瘤，將其作為一個細胞群體遺傳學問 題，而非一個發生於多個組織的、攜帶一系列 突變的腫瘤。他指出，這不是一個新的想法， 但現在有了新的工具，可以深入研究一個腫瘤的基因組學，從而為患者的癌症開發更多的定 量模型。

他還希望識別罕見的、攜帶抗性突變的細 胞群體。Gawad 認為，確定問題的唯一方法是 使用單細胞基因組學深入探索腫瘤的基因組 學。這樣，我們就可以了解這些因素是如何影 響患者的預后。然後，我們可以基於細胞分辨 率的腫瘤基因組學，更個性化地定製治療策 略。

Gawad 非常樂於使用這一技術。他熱愛他 正在做的事情，因為它會產生真正的臨床影 響。Gawad 鼓勵對遺傳異質性的其它領域—— 免疫學、神經病學和傳染病——感興趣的研究 人員考慮學習這一技術。儘管該技術還不成 熟，但它將會是繼第二代測序技術后基因組學 的下一個範式轉變。如果您提前掌握了第二代 測序技術，那麼你就走在科研的前沿了。

哈佛大學 (Harvard University)、波士 頓兒童醫院(Children's Hospital Boston) 的神經科學家 Chris Walsh 自研究所起就一直 在思考人腦的發育問題。現在，他開始使用單細胞基因組學解答這個問題。 他使用兩種類型的單細胞技術來了解神經

發生。在一組實驗中，他對單細胞進行 RNA 測 序，以描繪發育中的大腦的幹細胞類型。在另 一組實驗中，他對成年大腦中的神經元 DNA 進 行序列分析，以鑒別人類大腦皮質中某些 (但 不是全部) 神經元共享的突變，因為這些「體 細胞」突變可以幫助跟蹤腦細胞的譜系。

Walsh 指出，所有不同細胞都來自人類大 腦的永久標記，我們只需要做足夠的測序和解 讀。

該過程的解碼——計算分析是迄今為止 最難的部分。Walsh 認為，如果沒有哈佛大學 Peter Park 生物信息學實驗室的支持，他將 難以解讀得到的測序數據。

計算生物學家正在解決單細胞數據所帶來 的挑戰，對這些數據的解讀反過來又可提供職 業機會。Wolf Reik 在英國劍橋的 Babraham 研 究所實驗室的博士后研究員 Stephen Clark 更 喜歡開發新的方法和技術來提出具體的科學問 題。

Clark 指出，機會是很容易找到的，你可 以弄清楚什麼是可能的，什麼是最容易達到的 目標。例如，Reik 實驗室已經將單細胞 DNA 和 RNA 測序結合在一個，解決一個特定的問題， 所以他調整了方案來研究更多的細胞過程。

他幫助開發的這些技術和其它相關的方法 現已被用於多個項目，這些項目範圍很廣，從 胚胎髮育生物學到老年異質性等都有涉及。他 既喜歡這項工作的獨立性，又喜歡別人依靠他 開發這類技術。Clark 表示，他就是那個發明 新技術的人，並且很享受這種感覺。結束博后 生涯后，Clark 打算把重點放在技術開發上， 因為他喜歡這項工作，並且感覺今後對這類技 術的需求只會增不會減。

人類細胞圖譜計劃

破譯人體每個細胞的類型和特性

人類基因組計劃是當時最雄心勃勃的大科學工作，但比起描繪人體的每一種單細 胞類型，人類基因組計劃只能算得上「小巫」。這是因為前者涉及數百萬個體細胞的 分析。人體細胞圖譜計劃 (The Human Cell Atlas initiative) 於去年 10 月在倫敦舉行 的一次會議上啟動。來自世界各地的研究人員出席了這次會議。這一壯舉得到了 Chan Zuckerberg(扎克伯格夫婦合開的公司)的進一步支持。Chan Zuckerberg 計劃在加州 大學舊金山分校新建 Biohub 中心，其目標是「治癒、預防或治理所有疾病」。

英國維康信託桑格研究所 (Wellcome Trust Sanger Institute) 人體細胞圖譜研究 團隊的一位負責人 Mike Stubbington 表示，該計劃將開啟下一個生物研究的前沿。自 17 世紀中葉以來，生物學家已經嘗試對細胞類型進行分類。這種分類的依據包括形狀、 組織、位置和個體分子的成分。Stubbington 表示，目前我們還沒有一個詳細的細胞類 型目錄。該計劃將通過基因表達譜和它們最基本的空間位置來對細胞進行分類，以創 建人類細胞的圖譜。

人體細胞圖譜計劃將創建一個完整的細胞資源庫，並建立最優的相關規則，如為 數據設立最起碼的接納標準。會員將在實驗分析和數據處理中開發和分享新技術。下 一次會議將於 6 月 1 日至 6 日在斯德哥爾摩舉行，但是細胞圖譜的發布日期尚未確定。

Reik 剛開始進入單細胞基因組學領域的目 的也是為了解決一個科學問題。他的實驗室研 究表觀遺傳標記——DNA 序列上的化學標記， 指導蛋白質作用或不作用於特定基因。正是由 於表達和非表達 DNA 之間的差異，身體才得以 製造擁有相同遺傳信息的細胞類別，這種定向 分化在胚胎髮育和衰老中非常重要。

當時 Reik 已經在對少數細胞群體進行測 序，他認為，如果能直接對單個細胞進行測 序，那麼將十分有趣。Reik 認為自己的技術 已經很接近單細胞了; 而且從技術的角度來 看，單細胞測序應該非常有意義。

Reik 表示，這種「如果」的想法可能會推 動該領域走向美好的未來。例如，目前，細胞 必須在被測序之前被殺死。但是，隨著時間的 推移，保持細胞活力並對其進行測序，將能提 供細胞如何響應 DNA 甲基化 (Reik 將其作為表 觀遺傳標記) 的信息。因此，時間解析度將是 下一個重大挑戰之一。Reik 指出，將單細胞 測序與成像結合在一起，同時從物理和遺傳水 平上觀察細胞也「超級讓人興奮」。

然而，Amit 提醒研究者，單細胞測序若要 像第二代測序一樣普遍，那麼首先就需要克服 多個技術障礙。但是他強調研究人員應該考慮 方法論——換句話說，就是要重新研究他們提 出的科學問題，並在分子層面上尋找新的方法 來探討這些問題。總之，整個實驗設計需要重 新改良。

單細胞測序的早期採用者都是各自獨立地 開發自己的方法的。最初，只有少數實驗室研 究這項技術。當時學習這種技術的唯一方法就 是加入其中一個實驗室，就像 Gawad 一樣。

Orit Rozenblatt-Rosen 是馬薩諸塞州劍 橋博德研究所 (Broad Institute) 卡拉曼細 胞觀察台 (Klarman Cell Observatory) 的 副主任。2012 年，她幫助研究人員建立了這 個細胞觀測站，使他們可以首次開發和應用單 細胞方法。Rozenblatt-Rosen 表示，在她看 來，這些新技術非常激動人心。

隨後，她繼續與 Broad Institute 等機構 的合作者共同開展單細胞研究計劃，這使她能 夠參與開發和應用尖端技術，並學習領導和 導航大型合作項目所需的技能。Rozenblatt- Rosen 指出，她們的目標之一是幫助科學家學 習如何使用單細胞測序，所以她們做了相當多 的教學和傳播工作，幫助相關人員規劃實驗， 向他們展示如何使用技術，並協助分析計算結 果。Rozenblatt-Rosen 等人盡量增加平台設 備的數量和類型。必要時，她們還合作開發技 術。

在她自己的研究中，Rozenblatt-Rosen 使用單細胞測序來研究腫瘤細胞異質性—— 與 Gawad 一樣，她打算將腫瘤分解成由不同 遺傳特質組成的群體。今天，她特別感興趣 的是觀察腫瘤類型中免疫細胞間的差異，這 是因為只有一些癌症對免疫治療響應良好。 Rozenblatt-Rosen 選擇與馬薩諸塞州總醫院 (Massachusetts General Hospital)和達 納 - 法伯癌症研究所 (Dana-Farber Cancer Institute) 進行密切合作。目前她們正在建 立從醫院到 Broad Institute 的合作通道，以 管理接受臨床治療的病人的腫瘤樣本。她指 出，她們把研究和精準醫學銜接了起來，這讓 她非常激動。

美國能源部聯合基因組研究所 (US Department of Energy's Joint Genome Institute, JGI) 的 Tanja Woyke 指出，隨著 該領域的研究日漸成熟，技術培訓的機會也越 來越多了。一些實驗室接待訪問科學家，其他 實驗室提供談話指導，更多的實驗室還提供研 討會和課程培訓。

Woyke 表示，單細胞方法與宏基因組學 (研究所活在特定環境中的許多物種的基因 組)是「非常互補的」。例如，人們可以使用 宏基因組學方法對少量土壤中的所有微生物的 DNA 進行測序，然後對該從該樣品中發現的幾 種生物進行單細胞測序，最後比較所有測序數 據。

如果有人對單細胞基因組學有興趣，但沒 有相關技術知識，不必擔心，JGI 參與了社區科學計劃 (Community Science Program，參 見 go.nature.com/2ql2sth)，可以為申請者 提供單細胞分離、基因組擴增和測序的培訓。 不過，Woyke 提醒，需要注意的是，所研究的 問題必須與能源部的生物能源、碳循環和生物 地球化學領域相關，且申請者必須提交一份需 要接受同行評議的項目方案。

JGI 現在每年對數千個單細胞進行測序。 Woyke 表示，目前的需求非常高。她認為單細 胞測序的需求增長是不可避免的，特別是在微 生物學方面，因為只有約 15% 的已知微生物 可以人工培養，其它 85% 必須通過單細胞方 法測序。隨著技術成本的下降——她認為這是 必然的——單細胞基因組學將成為每位分子生 物學家工具箱中的重要工具，就像第二代測序 技術那樣。

原文檢索：

Nature: The genetic microscope