【聚焦】非靶向和靶向代謝組學在藥物靶點發現中的應用（獨家原創）

「第二屆-選出您心目中的藥品研發帝國」微信投票活動

非靶向和靶向代謝組學在藥物靶點發現中的應用

范仕成，高悅，張慧貞，黃民，畢惠嫦*

（中山大學藥學院，廣東 廣州 510006）

[ 摘要] 代謝組學是運用多種技術手段，研究所物體系中小分子代謝物的種類、數量及變化規律的科學，是系統生物學的重要組成部分，根據研究目的的不同分為非靶向和靶向代謝組學。非靶向代謝組學是對生物體內源性代謝物進行系統全面的分析；靶向代謝組學則是針對特定的某一類代謝物進行分析。隨著信息科學和分析技術的發展，運用代謝組學研究疾病機制和發現藥物靶點的方法日趨成熟，其重要性也日益凸顯。通過典型實例，介紹非靶向和靶向代謝組學及二者結合在腫瘤、代謝性疾病等藥物靶點發現中的作用，為深入理解代謝組學在疾病機制研究和藥物靶點發現中的重要作用提供參考和啟示。

[ 關鍵詞] 代謝組學；藥物靶點；疾病機制

代謝是生物體內所有生物化學反應的總稱，代謝活動是生物體維持生命的物質基礎，對代謝物的分析是研究所命活動分子基礎的一個重要方面。代謝組學最初由英國帝國理工大學Jeremy Nicholson 教授提出，他認為代謝組學是將人體的生理病理過程作為一個動態的系統，研究所物體被內、外環境因素擾動后其內源代謝產物種類、數量及其變化規律的科學。其核心任務包括檢測、分析和探索代謝物質的整體變化規律，並通過這種變化規律研究機體生命活動發生、發展的

本質。

基於分析技術和信息技術的迅猛發展，代謝組學發展迅速，與基因組學、轉錄組學、蛋白質組學等共同組成「系統生物學」，並在系統生物學研究中起著重要作用。與其他組學相比，代謝組學具有明顯的優勢：1）代謝物水平上發生的變化更易於檢測；2）相較於基因組學和蛋白質組學需要進行全基因組測序和建立含有大量表達標籤的資料庫，代謝組學分析手段更為簡易；3）與基因和蛋白數量相比，代謝物數量少，易於確證和進行後續分析；4）生物樣本的代謝物和代謝通路變化可以系統地揭示機體生理病理狀態。

根據研究目的的不同，可以將代謝組學分為非靶向和靶向代謝組學。非靶向代謝組學是對生物體內源性代謝物進行系統全面的分析，是一種無偏向的代謝組學分析；靶向代謝組學則是針對特定的某一類代謝物進行的分析，是一種有偏向的代謝組學分析。非靶向和靶向代謝組學各有優缺點，二者結合可作為差異代謝物的發現和準確定量的有力工具，在靶點發現的過程中發揮重要作用。非靶向和靶向代謝組學在疾病研究、疾病動物模型的確證、藥物研發、藥物篩選、藥效及毒性評價、藥物作用機制和臨床評價、植物代謝功能、微生物代謝功能研究等方面有著廣泛的應用。在疾病研究領域，代謝組學的應用主要集中在病變標誌物的發現、疾病的診斷、治療和預后的判斷。功能代謝組學是傳統代謝組學概念的深化和延伸，採用非靶向和靶向代謝組學分析方法，對不同的生物樣本（如血、尿、組織、糞便等）進行分析，從而發現與特定疾病表型密切相關的代謝物差異和代謝通路變化，進一步結合生物學研究，探索代謝物功能和疾病的發生髮展機制，發現相關靶點並進行功能學驗證（見圖1）。目前，功能代謝組學已成為研究所命活動發生髮展機制、藥物靶點發現等的有效手段。

本文將介紹非靶向和靶向代謝組學及其相關技術，並重點以實例說明代謝組學在藥物靶點發現中的應用。

1 非靶向代謝組學

非靶向代謝組學是在有限的相關研究和背景知識的基礎上，對整個代謝組進行系統、全面的分析，獲取大量代謝物的數據，並對其進行處理，從而找出差異代謝物的一種研究方法。目前，非靶向代謝組學分析在生物標誌物的發現、疾病的診斷和機制研究等方面應用廣泛，並且為解決一些疾病機制研究的瓶頸問題提供了新的思路和方向。

1.1 基本流程

1.1.1 樣本的採集、前處理與分析

樣本的採集是代謝組學研究的初始步驟也是最重要的步驟之一，常用於代謝組學分析的樣本包括血漿、尿液、各種組織及細胞、細胞器等。代謝組學研究要求嚴格的實驗設計，足夠大的樣本量可有效減少因生物樣本個體差異造成對分析結果的影響，從而得到有統計學意義的數據。

樣本前處理的目的是從成分複雜的生物樣本中提取出被分析物，減少其他成分對測定結果的干擾，也是影響代謝組學研究結果的關鍵因素。常用的樣本前處理方法包括固相萃取、液液萃取、超臨界流體萃取、加速溶劑萃取、蛋白質沉澱、差速離心等。

使用單一的分析技術往往不能滿足代謝組學的分析要求。因此，代謝組學常需要多種分析手段的結合。近年來，核磁共振（NMR）、氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）、液相色譜-質譜聯用（LC-MS）以及毛細管電泳-質譜聯用（CE-MS）已被廣泛應用於代謝組學的研究中。分析手段的進步與代謝組學的發展密不可分，是代謝組學學科發展的主要推動力之一。

1.1.2 數據處理

代謝組學數據需要通過分析和比較找出差異代謝物。常用的數據分析方法包括主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析（partial least squares projection to latentstructuresdiscriminant analysis，PLS-DA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal projections to latent structuresdiscriminantanalysis，OPLS-DA） 等。應根據實際情況選擇適宜的分析手段，從而得到可信的分析結果，同時還需結合t 檢驗和變數權重重要性排序（variableimportance in projection，VIP）值篩選差異性代謝物，一般認為同時滿足P 小於0.05 和VIP 值大於1.0 的變數為有差異的代謝物。

隨著代謝組學分析技術日漸成熟，各種代謝組學資料庫和處理軟體也越來越多（見表1）。根據不同的分析方法，可以在不同的資料庫里對化合物譜圖進行歸屬，從而得出差異代謝物的化學結構和名稱。在藥物靶點的發現過程中，往往需要進行進一步的機制研究，此時可利用KEGG、Metacyc 等資料庫進行代謝通路分析，以便掌握相關的代謝通路並開展後續研究。

1.2 在靶點發現中的應用實例

1.2.1 發現心血管疾病治療的潛在靶點

氧化三甲胺（trimethylamine N-oxide，TMAO）的含量升高會引起脂質的異常累積，從而增加罹患心血管疾病的風險。Wang 等在對心血管疾病的研究中，採用非靶向代謝組學分析顯示心血管疾病患者血漿內TMAO 的含量明顯升高。從食物中攝取的膽鹼類物質能在腸道菌群中膽鹼-三甲胺（TMA）裂解酶的作用下生成TMA，後者進一步在肝臟經黃素單加氧酶3（flavinmonooxygenase3，FMO3）催化代謝生成TMAO。進一步研究表明，FMO3 過表達轉基因小鼠在相同的高膽鹼飲食條件下，其血漿內TMAO的含量明顯高於野生型小鼠。通過反義寡核氨酸技術沉默FMO3 表達的小鼠，其血漿中TMAO 的含量顯著低於對照組，表明FMO3 能通過調節血漿內TMAO 含量進一步影響動脈粥樣硬化及其他心血管疾病的發病過程。上述源於代謝組學的研究表明，FMO3 可能成為治療心血管疾病的潛在靶點。

1.2.2發現神經系統疾病治療的潛在靶點

在一項對神經性疼痛的病理機制研究中，Patti 等建立了神經性疼痛的大鼠模型，並取大鼠背角、背根神經節、脛神經和血漿進行非靶向代謝組學分析，發現模型組大鼠內源性代謝組顯著改變，其中神經鞘脂二甲基鞘氨醇（N，N-dimethylsphingosine，DMS）的水平在患有神經性疼痛的大鼠的脊髓中顯著增加。進一步生物學功能驗證發現異常增加的DMS 水平可以在大鼠體內誘導疼痛樣行為，導致多種炎性細胞因子分泌增加，對神經性疼痛的產生起到關鍵作用。DMS 作為一種內源性代謝物，其含量與S-腺苷-L-甲硫氨酸依賴性N-甲基轉移酶（SAM-dependentN-methyltransferase）的活性密切相關，抑制該甲基轉移酶可以作為通過阻斷DMS 產生來治療慢性疼痛的潛在方法，因此該甲基轉移酶可能成為慢性疼痛的潛在治療靶點。

1.2.3發現腫瘤治療的潛在靶點 Gao 等利用毛細管電泳-質譜技術，對神經膠質瘤樣本進行非靶向代謝組學分析，發現瘤組織中的亞牛磺酸含量顯著高於癌旁對照組織中的亞牛磺酸，並且與膠質瘤分級（惡性程度）呈正相關。經過分子對接計算機模擬，Gao 等發現亞牛磺酸能夠競爭性抑制脯氨酸羥化酶2（prolylhydroxylasedomain-2，PHD2）的催化活性，影響羥基化缺氧誘導因子-1α（hypoxia-induciblefactor 1α，HIF-1α）的降解，促進其入核，從而啟動許多與腫瘤相關基因的表達。因此，細胞內亞牛磺酸的含量升高可促進腫瘤的發生髮展。研究發現，細胞內亞牛磺酸以胱氨酸為前體物質合成，而胱氨酸需通過胱氨酸/谷氨酸反向轉運體（XC-glutamate-cystineantiporter）的轉運才能進入細胞，抑制該轉運體可以阻斷亞牛磺酸的生物合成，從而抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲。因此，胱氨酸/谷氨酸反向轉運體可能可以作為治療神經膠質瘤的潛在靶點。

在一項急性髓細胞白血病的研究中，Bhanot等利用多種酪氨酸激酶抑製劑對白血病癌細胞株進行處理，對不同處理的細胞株進行非靶向代謝組學分析，發現癌變髓細胞內源性代謝組顯著改變，一系列內源性代謝物，如與糖酵解、三羧酸循環、糖原合成等能量代謝相關的代謝物顯著改變，其中糖原合成前體UDP-D-葡萄糖水平在癌變細胞株內異常升高。進一步機制研究表明，腫瘤細胞代謝重編程依賴糖原合成途徑，進行能量儲備。糖原合成酶1（glycogensynthase 1，GYS1）活性異常升高的患者往往預后較差。抑制GYS1 不僅降低糖酵解通量，而且導致腫瘤細胞生長受到抑制。新的靶向治療策略可以靶向抑制GYS1，從而影響腫瘤細胞能量代謝和生長，故GYS1有望成為新的治療靶點

2 靶向代謝組學

靶向代謝組學是按照代謝組學的原理和思路，只對有限的幾個或幾類與生物學事件相關的代謝物進行分析和研究的方法。通常在通過非靶向代謝組學發現差異代謝物之後，再利用靶向代謝組學進行進一步系統的確證。近年來新發展起來的糖組學、脂質組學等也屬於靶向代謝組學的範疇。與非靶向代謝組學相比，靶向代謝組學在分析上更具有針對性，與非靶向代謝

組學優勢互補，是代謝組學的重要組成部分。

2.1 基本流程

2.1.1 樣本的採集、前處理與分析

靶向代謝組學與非靶向代謝組學分析所用的樣本類型相似。但在樣本前處理方面，因靶向代謝組學更具有針對性，基於目標代謝物或代謝組，在提取方法的選擇上可能與非靶向代謝組學存在一定的差別。例如，進行脂質組學研究是以提取出更多脂質為目的，所以選用的溶劑多對脂質具有較好的溶解能力，與一般代謝組學研究選用的溶劑差別較大，提取方法上也存在較多不同。靶向代謝組學與非靶向代謝組學所採用的分析儀器基本相同。

2.1.2 數據處理

靶向代謝組學只重點研究已知可能具有生物學效應的幾種或幾類代謝物，因此其數據處理相比於非靶向代謝組學更為簡單方便。其數據處理方法和使用的資料庫與非靶向代謝組學相似，但針對某類代謝物，如糖類和脂質組，通常還有LipidMaps、LipidBank等特定的資料庫。

2.2 在靶點發現中的應用實例

Marien 等對正常和肝臟鱗狀細胞瘤組織樣本進行了靶向磷脂的脂質組學分析。結果發現，癌症組織中長鏈醯基磷脂的含量顯著高於正常組織。進一步研究發現，癌症組織中長鏈醯基磷脂含量的增加與醯基鏈延長酶（acyl chain elongases，ELOVLs）有關。篩選后發現，ELOVL6 與癌症組織中磷脂醯基鏈的延長關係最為密切。ELOVL6 被抑制后能夠顯著降低鱗狀細胞瘤細胞的集落形成能力；同時，動物實驗表明其被抑制後會顯著減慢皮下移植瘤的生長。說明ELOVL6 能通過調節長鏈醯基磷脂的含量影響鱗狀細胞瘤的發生和發展，從而可以作為鱗狀細胞瘤治療和藥物研發的潛在靶點。

Nomura 等對黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌等多株腫瘤細胞的蛋白組學進行研究，發現一種脂肪分解酶單醯基甘油脂肪酶（monoacylglycerol lipase，MAGL）表達較正常組織和細胞異常升高，該酶的生物學功能主要是分解脂肪釋放出遊離的脂肪酸，通過脂肪酸氧化等途徑進行能量供應。研究人員進一步對腫瘤細胞株和癌變組織進行脂質組學研究，發現多種遊離脂肪酸異常升高，腫瘤侵襲、轉移的關鍵信號分子，如溶血磷脂酸（lysobisphosphatidic acids，LPA）和前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）等的表達也異常升高。一方面，抑制MAGL 的活性在降低癌變組織與細胞中遊離脂肪酸的同時，癌細胞的轉移、侵襲能力也受到影響；另一方面，過表達MAGL 或通過高脂飲食大量攝入外源脂肪酸，均會提高腫瘤的惡性程度和侵襲性。因此，MAGL 活性升高可促進癌細胞更有效率地從中性脂質中分解遊離的脂肪酸用於能量供給。通過蛋白質組學和靶向代謝組學的研究，發現MAGL 可作為抑制癌細胞能量代謝的有效靶點。

3 非靶向和靶向代謝組學結合在靶點發現中的應用

非靶向和靶向代謝組學各有優勢和不足。非靶向代謝組學作為一種無偏向的代謝組學分析，樣品處理簡便，能全面系統地反映生物樣本的代謝組特徵；但是其線性範圍有限，重複性較差，代謝物確證複雜。靶向代謝組學線性範圍寬，具有較好的重複性和敏感性，代謝物確證簡單；但需事先了解被分析物質的相關信息，是一種有偏向的代謝組學分析。二者結合可作為差異代謝物的發現和準確定量的有力工具，在靶點發現的過程中發揮重要作用。因此，現在越來越多的研究將2種手段相結合，以期得到更準確的信息和實驗結果。

3.1 發現腫瘤治療的潛在靶點

異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）已被證明與多種腦腫瘤相關，其突變會引起酶功能發生明顯變化，失去催化異檸檬酸生成α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）的能力。在一項神經膠質瘤的研究中，Dang 等使用IDH1 突變和未突變的U87MG 惡性膠質瘤母細胞進行非靶向代謝組學分析，結果發現IDH1 突變后的細胞中，2-羥基戊二酸（2-hydroxyglutarate，2-HG）的含量明顯高於未突變的細胞。之後用人類神經膠質瘤樣本進行靶向代謝組學分析作為驗證，主要靶向分析α-KG、2-HG 和三羧酸循環中的相關代謝產物。結果發現IDH1 突變型樣本中α-KG 的含量略小於野生型樣本，但不存在顯著性差異；而2-HG 的含量在兩組之間存在顯著差異；三羧酸循環中的相關代謝產物在野生型和突變型樣本之間不存在顯著差異。進一步研究表明，IDH1 發生突變后產生一種新的能力，即催化α-KG 生成2-HG，而2-HG 與α-KG結構相似，高濃度的2-HG 會抑制α-KG 依賴性的酶的活性，從而引起染色質的甲基化以及細胞增殖，誘發腫瘤。目前已研製出突變型IDH1 抑製劑AGI-5198，經實驗證明其具有抗腫瘤作用，能顯著抑制2-HG 的產生。

3.2 發現糖尿病治療的潛在靶點

Prentice 等在對妊娠糖尿病的研究中，通過非靶向和靶向代謝組學研究揭示妊娠糖尿病患者血漿內源性代謝組顯著改變，進一步篩選發現脂肪酸代謝物3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸（3-carboxy-4-methyl-5-propyl-2-furanpropanoicacid，CMPF）水平顯著上升。機制研究表明，CMPF 降低β 細胞ATP 生成，影響其線粒體功能，導致β 細胞損傷，胰島素分泌下降，患者糖耐量降低，最終誘發糖尿病。研究人員進一步發現抑制有機陰離子轉運蛋白-3（organic anion transporter3，OAT-3）可阻斷CMPF 轉運進入β 細胞使其免受損傷，表明OAT-3 可作為調控β 細胞功能的潛在靶點。

3.3 發現治療缺血再灌注損傷的潛在靶點

缺血再灌注損傷是指缺血的器官恢復血流后，組織器官的損傷反而加重的現象。這種組織損傷被認為主要是由於先前被剝奪血液供應的組織區域氧化應激和過量活性氧簇（ROS）蓄積所造成。Chouchani 等對缺血再灌注小鼠模型的肝、腎、腦、心臟4 個組織進行靶向和非靶向代謝組學分析，發現線粒體能量代謝重要中間體琥珀酸水平在缺血再灌注小鼠組織中異常升高。進一步機制研究表明，缺血組織中琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase, SDH）活性異常升高導致琥珀酸蓄積，使得線粒體電子呼吸鏈複合物Ⅰ電子正向流動受阻，ROS 過量蓄積，線粒體功能顯著降低，最終導致嚴重的組織損傷。進一步功能驗證實驗發現，建立小鼠缺血再灌注模型，對SDH 的藥理性抑制可以有效地減少缺血再灌注組織區域線粒體ROS 蓄積，緩解其所造成的組織損傷。這些結果表明，SDH 可能是治療缺血再灌注損傷的潛在靶點，其抑製劑開發可能成為新的治療途徑。

4 結語與展望

非靶向和靶向代謝組學在靶點發現和機制研究等方面有非常大的優勢，二者在心血管疾病、神經系統疾病、腫瘤等疾病機制研究及靶點發現方面發揮了重要作用（見表2）。但是，代謝組學為系統生物學所提供的信息僅限於代謝物，並不足以全面解決複雜的生物學問題。因此，有必要對研究對象進行多組學的全面研究，整合各種高通量的組學數據，充分發掘這些數據中的生物學意義，才能全面闡釋各種生物學事件的本質。同時，可以通過構建代謝網路和代謝流變化的數學模型，結合細胞生物學和動物模型的數據和知識，在生物學水平上進行分子功能學驗證，最終闡明生命活動及生理病理機制，發現前景良好的藥物靶點。

可見，隨著分析技術和數據處理技術的進步和發展，代謝組學結合其他多組學數據，將為疾病研究和藥物靶點發現作出更突出的貢獻。

【專家介紹】 畢惠嫦：博士，中山大學藥學院教授、博士生導師、副院長。1997 年畢業於藥科大學英語藥學專業（1993—1997 年）；2007 年畢業於中山大學藥學院（2002—2007 年），獲藥理學博士學位。2011—2012 年在美國國立衛生研究院作訪問學者。目前擔任藥理學會臨床藥理學專業委員會副秘書長 / 常委、廣東省藥理學會治療藥物監測專業委員會副主任委員、藥物篩選與評價專業委員會常務委員、藥物毒理專業委員會委員、廣東省執業藥師協會第三屆理事會理事。擔任 Journal of Biochemical and Molecular Toxicology、Chinese Medicine、《生化藥物雜誌》編委，《藥學學報》及 Acta Pharmaceutica Sinica B 青年編委。畢惠嫦教授研究方向為代謝調控，專註於研究內外源物代謝調控對疾病及臨床用藥的影響。主持國家省部市各級課題 20 多項，已發表中英科研論文 100 多篇，其中 SCI 科研論文 70 多篇，主編並出版專著 2 部，參編 5 部。獲2014 年藥理學會 -Servier 優秀青年藥理學工作者獎，獲 2015 年國家自然科學優秀青年科學基金。

●感謝您閱讀《藥學進展》微信平台原創好文，也歡迎各位讀者轉載、引用。本文選自《藥學進展》2017年第4期。

●《藥學進展》是一本專註於醫藥領域前沿動態的專業媒體，月刊，銅版紙全彩印刷，全年360元，歡迎訂閱！編輯部官網：www.cpupps.cn；電話：025-83271227。

● 由《藥學進展》編委會主辦的「第三屆藥學前沿高峰論壇」將於6月26日-28日在上海張江長榮桂冠酒店召開，誠摯相邀！

郵編：210009

聯繫電話：025-83271227

聯繫人：

」

媒 體 招 募

○

2017年6月01日- 11日——「第二屆-選出您心目中的藥品研發帝國」微信票選活動；

○

2017年6月26日- 28日——上海——「第三屆藥學前沿高峰論壇」；

○

2017年9月08日- 10日——重慶——「世界智能科技大會(醫藥分論壇)2017醫藥創新峰會」。

兩會一活動，媒體招募火熱進行中......

拿出你的熱情，伸出我的雙手，一起擁抱這瘋狂的夏天！

媒體合作連線

「世界智能科技大會(醫藥分論壇)2017醫藥創新峰會」參會報名，美女客服等你來諮詢。

023-62988285轉8045

記得打給我哦！