引物選得好，測序沒煩惱！｜微生物

「微生物組」（Microbiome）是指由多種微生物聚居在一起形成的生態群落，從人和動物的腸道，到植物、土壤、海洋，它們無處不在，推動著地球物質循環，影響著人體乃至整個地球生物圈的健康。

近年來，得益於低成本高通量基因測序技術的發展、計算和成像技術的改進，以及用於數據分析的生物信息學工具的革新等進展，高通量測序走下神壇，變得平易近人，使得更多的學科領域開始投入到微生物組學的研究中來。

對於微生物組學的研究，最常見的就是對微生物群落結構多樣性的研究。也就是通過二代測序技術對16S rDNA/18S rDNA/ITS等序列進行測序，獲得樣品中的微生物群落組成以及相對丰度。探討微生物多樣性對於研究微生物與環境的關係、環境治理和微生物資源的利用有著重要的理論和現實意義。

那麼問題來了

你真正了解16S測序嗎？

為什麼選擇16S測序？

16S測序區域又該如何選擇？

今天，我們就來聊聊16S測序中的引物選擇。

首先要了解一下16S是個啥？

詳情在之前的16S專題中詳細說過，16S是一段序列，是原核微生物的「身份證」，你拿到這段序列，再跟資料庫一比對，所有的物種信息你就完全明了了。因為操作簡單，可行性高，比對信息準確，所以被認為是微生物多樣性組學研究中最常用的檢測手段。

16S說完了，再來了解一下16S測序區域是個啥？

16S rRNA為核糖體的RNA的一個亞基，16S rDNA就是編碼該亞基的基因。16S rDNA基因全長1542 bp，由9個可變區（V1-V9）和10個保守區組成。不同種類的細菌有相同的保守區序列和不同的可變區序列，因此可以根據保守區序列設計引物來擴增環境樣品中所有細菌16S rRNA基因，而根據可變區序列來區分不同種類的細菌。

圖1 16S rDNA基因組成（綠色為可變區）

傳統方法中最常用的引物是27F和1492R，幾乎能擴增出完整的16S rRNA基因全長，由於目前二代高通量測序的讀長限制，該引物不適用於高通量測序平台，但被廣泛用於純菌的分子鑒定。考慮到目前主流高通量測序平台讀長的限制，只能對16S rDNA的某一段可變區進行測序。有文獻中選擇測單V區（V3/V4/V6），有的測雙V區（V3-V4區或V4-V5區），還有的選擇三V區（V1-V3區、V5-V7區或V7-V9區）進行16S rDNA測序。

那麼問題又來了，到底選啥才能測的穩准狠啊？！

別急，且聽小編慢慢道來~

想測的准，毫無疑問當然長度越長越準確嘛，但是出於經濟實惠的角度考慮，其實測雙V甚至單V區已經足夠。一般而言，環境微生物組學常用的，也是認可度比較高的測序區域是V3-V4，V4-V5，或者單測V4區。

那不同的測序區域對數據結果有什麼影響呢？

先來看看中科院周寧一老師於2013年發表在AEM雜誌的一篇文章（IntragenomicHeterogeneity of 16S rRNA Genes Causes Overestimation of Prokaryotic Diversity），研究比較了16S不同區域的測序結果，所選擇的引物如下：

研究結果顯示，V4-V5區域是最佳的測序區域，造成的基因組內異質性最小。

也就是說一般會選擇常用的V4-V5區，引物515F/907R 或者515F/926R。這也是羅氏454測序時代最常用的16S測序引物。

在Illumina時代，由於平台測序長度的限制，V4單區測序（515F/806R）被更為廣泛地使用。也是地球微生物計劃中推薦使用的引物序列（想了解地球微生物組戳這裡：）。

圖2 地球微生物組計劃中使用的16S測序引物

傳統的V4區引物，由Caporaso等科學家(2012)設計，對細菌的覆蓋度高，也可以同時檢測到部分古菌。然而隨時資料庫的日益更新，我們發現這對引物雖好，但還是有改善空間的。既然可以細菌古菌通測，那我們能不能改進一下，讓古菌覆蓋的更廣泛一些。

轉眼到了2015年，Parada等科學家發現，傳統的V4區引物（515F/806R），會對海洋中SAR11群落的檢測造成低估，同時對γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）造成高估，因此他們對傳統V4區引物的515F的一個兼并鹼基做了改進，並結合926R引物，對海洋中的微生物多樣性進行了檢測，發現改進后的515F引物可以有效地改善擴增偏好性。

秉承著追求科（wu）學（mei）嚴（jia）謹（lian）的目標，越來越多的科學家想要在有限的經費內獲得更多覆蓋面更全的序列信息，於是Apprill等科學家在515F改善的基礎上，進一步改善了806R端（嗯，也是只改了一個兼并鹼基而已），相比原先的806R端其覆蓋面更廣了。他們推銷的口號是「我的片段雖然短！花錢更少測的好！」

好吧，Caporaso眼看自己辛苦設計出來的引物都被改進了，雖然改的好，但直接說出來豈不是太沒面子了。於是2016年，幾個相關科學家聯手發表了一篇文章（Walters et al. 2016），使用不同的環境樣品對這幾對引物進行了比較。最後研究證明，改進后的V4區引物（515F/806R）確實效果不錯，相比之前，不僅對細菌群落的檢測進行了矯正，還可以多測出來好多古菌，一舉兩得！

註：上表是改進前後引物序列的詳細信息，改進的鹼基用黑體加粗了。

此文發表后，地球微生物組計劃也與時俱進的把這兩對改進后的引物列在了自己的網站，希望更多的環境微生物組學科學家可以來規範使用引物，方便進行不同環境的研究對比。截止目前，短短不到一年時間內，谷歌學術檢索到引用改進后V4區引物（515F/806R）的文獻已有8篇，其中包括一篇Cell（Sampsonetal.2016）和一篇Nature Microbiology（Snijdersetal.2016）。

因此對於環境樣本而言，使用改進后的V4區引物（515F/806R）及515F/926R，可能在行業標準日益規範的今天，是一個更好地選擇，今後應該會成為16S檢測微生物多樣性測序的首選。

簡而言之，V4單區測序（改進后的515F/806R引物）將是16S測序的主力~

那麼最重要的問題來了！！！

這麼好用的引物，聯川作為業內領先的微生物組學研究服務商，收入了嗎？

這還用說，早已收入囊中~

• 實驗周期縮短

• 測序深度擴大

• 引物擴增偏好性得到改善

• 檢測結果覆蓋面更廣

夠不夠~

這些就是吸引你來理由~