重大發現：張毅組Nature揭示基因印跡的新機制【附朱冰點評】丨BioArt特別推薦

的BioArt按：基因印跡（genomic imprinting）是一個經典的表觀遺傳現象，是指子代中某些特殊位點的基因僅表達來自父源或母源的等位基因，而對應的另一個等位基因表現為轉錄沉默。目前關於調控基因印跡的分子機制的研究主要認為與等位基因調控區的差異性DNA甲基化以及某些長鏈非編碼RNA的參與有關。然而是否還存在其它調控基因印跡的新機制，目前尚未有明確報道。7月19日，哈佛醫學院張毅教授課題組在Nature雜誌上以長文形式（Article）發表了題為「Maternal H3K27me3 controls DNA methylation-independent genomic imprinting」的重量級研究論文，首次證明了DNA甲基化以外的另一種重要的表觀遺傳修飾H3K27me3調控某些印跡基因發生的分子機制。這一成果對進一步完善基因印跡發生的機理具有重要的意義，是基因印跡領域具有里程碑式意義的發現，這一原創性發現也將會寫進表觀遺傳學相關的教科書中。鑒於該成果的重要意義，BioArt特別邀請到了傑出的表觀遺傳學家、中科院生物物理所朱冰研究員做精彩點評，以饗讀者！

眾所周知，哺乳動物是二倍體，在哺乳動物中絕大部分等位基因不管是來自父源還是母源基本上都會同時表達或者關閉。然而，從上個世紀90年代起，科學家陸陸續續發現了一系列特殊的基因，其父源或者母源的等位基因的表達存在差異，而這種基因差異表達的調控主要受表觀遺傳調控，這類基因稱之為印跡基因（ imprinting gene），這種表觀遺傳學現象被稱為基因印跡（genomic imprinting）【1】。（BioArt溫馨提示：有關基因印跡的相關詳細內容，請閱讀Denise P. Barlow和 Marisa S. Bartolomei 2014年發表在Cold Spring Harbor perspectives in biology上的綜述論文「Genomic Imprinting in Mammals」，該文也收錄在David Allis主編的第二版《Epigenetics》教材中。）

基因印跡並非存在所有的真核生物中，從目前的研究來看主要存在於哺乳動物、昆蟲和少數植物中（例如玉米和擬南芥）【1】。1984年，來自美國Wistar研究所的科學家JamesMcGrath和DavorSolter在Cell上發表文章，通過核移植實驗證明了只有同時具備雙親染色體的胚胎才能存活，而含有兩份父源基因組（biparental gynogenones）或者兩份母源基因組（biparental androgenones）的胚胎則不能完成正常的胚胎髮育，這表明父源和母源基因組對於胚胎髮育的貢獻存在較大的差異性【2】。無獨有偶，差不多同一時期來自英國劍橋的科學家Azim Surani（BioArt注：北京大學湯富酬教授的博士后導師）等人也發現了類似的現象，並首次提出了基因印跡這一重要表觀遺傳學概念（他在Nature論文中寫道，「We propose that specific imprinting of the genome occurs during gametogenesis so that the presence of both a male and a female pronucleus is essential in an egg for full-term development」）【3】。

自1991年3個重要重要的印跡基因Igf2、Igf2r和 H19差不多在同一時期被不同的實驗室報道以來【4,5,6】，目前在人類和小鼠中已經發現了大約150個印跡基因（下圖）【7】。

小鼠染色體上印跡基因的分布圖。 紅色表示母源表達基因， 藍色表示父源表達基因。圖片引自http://www.har.mrc.ac.uk/research/genomic_imprinting

此後隨著對印跡基因的深入研究發現，許多基因的印跡表達是由不同親本來源的等位基因調控區的差異性DNA甲基化（differentially methylated region， DMR）造成的，而且印跡基因大多以基因簇的形式存在，目前所有已知的印跡基因簇中都至少包含 1～2 個 長鏈非 編 碼 RNA【8】。

儘管 DNA 甲基化的差異在基因印跡的建立和維持過程中具有重要作用，然而也有一些研究表明純粹的DNA甲基化差異調控並不足以解釋某些基因印跡的發生，特別是最近有報道表明有些印跡基因的產生並不依賴與DNA的甲基化【9，10】，這表明可能還有其它的表觀遺傳機制參與其中。儘管過去有研究表明包括H3K27me3在內的組蛋白修飾與印跡基因的產生有一定的相關性，然而這些印跡基因的位點都與臨近的差異性DNA甲基化區域存在一定的關聯【11】。因此，發現不依賴於DNA甲基化的基因印跡新機制具有十分重要的意義。

在這篇文章里，張毅實驗室的工作證明親本基因組上差異組蛋白上H3K27me3修飾是一個新的基因印跡的調控機制。事實上，這項研究是基於該課題組去年在Cell上發表的一項工作，在該項工作里張毅實驗室開發了一個用少量細胞進行DNase I超敏感位點（DHS）全基因組譜測序分析的liDNase-seq技術【12】。由於精子DNA通過纏繞在精蛋白上緻密包裝，因此精子和卵子細胞中染色質上DHS位點差異非常大，研究人員發現在小鼠受精後母源染色質上DHS很大程度上繼承了卵子中的狀態，而父源染色質上DHS很快（7小時內）已經被重編程成類似於母源染色質的狀態。雖然親本之間整體水平上已經很像，但是在某些位點仍然存在明顯的親本特異性。這其中包括一些已知的印跡基因位點（下圖）【12】。

在這篇新的研究中，研究人員從1細胞期小鼠胚胎中物理分離了母原核與父原核，並對其通過liDNase-seq技術分析了高解析度的父本以及母本的DHS，從而鑒定了數百個親本特異的DHS位點。這些位點包含了很多已知的基因印跡控制區域。例如很多母源印跡基因印跡控制區域只在父源染色質存在DHS，而母源染色質中沒有。因此，研究人員猜測其它親本特異的DHS位點可能包含新的基因印記控制區域。因為小鼠胚胎轉錄激活從二細胞期開始，因此通過分析二細胞期親本特異的轉錄激活，研究人員證明多數親本特異激活的基因在啟動子區域存在親本特異的DHS，從而暗示這些基因可能是新的印跡基因。

因為早先的研究表明DNA甲基化是哺乳動物中基因印跡建立唯一已知機理，因此接下來為了研究這些親本特異DHS建立的機理，研究人員觀測了這些區域的DNA甲基化狀態。研究發現這些DHS區域只有部分在沒有DHS的親本中表現出高DNA甲基化，而很多區域既沒有DHS也沒有DNA甲基化。因此研究人員猜測在這些區域可能存在其他表觀遺傳修飾阻礙DHS的建立。

DNA甲基化之外已知的主要參與轉錄抑制的染色質修飾包括組蛋白上H3K27me3和H3K9me3兩種修飾，因此研究人員嘗試通過過表達相應的去甲基化酶Kdm6b和Kdm4d去除這些修飾看哪些位點的差異DHS受這些修飾影響。結果表明有幾十個親本特異DHS受H3K27me3去除的影響，同時這些DHS在被沉默的位置基本沒有DNA甲基化發生。這表明在不依賴於DNA甲基化的親本特異DHS區域H3K27me3控制了這些區域的關閉。

這些一細胞期新鑒定的親本特異DHS一方面可能是新的候選印跡基因控制區域，另一方面可能只是短期內還沒有完成的重編程過程的中間狀態區域。因此接下來研究人員查看了這些位點是否可以隨著發育的進行被保留下去。為了進行高解析度的親本特異DHS鑒定，研究人員通過一細胞期雌雄原核交換構建了只有父源染色質的孤雄胚胎（AG）與只有母源染色質的孤雌胚胎（PG）。這些胚胎可能進行正常的著床前發育。通過對AG和PG桑椹胚時期的DHS分析研究人員發現了247個父源（AG）特異的DHS，這其中有105個落在母源沒有DNA甲基化並且有母源特異H3K27me3的區域並且這些表觀遺傳狀態是從1細胞期遺傳到了桑椹胚時期。表明這些親本特異DHS是可以隨發育遺傳的，其附近有76個基因，這些基因可能是新的印跡基因。這些基因中有28個在AG或者PG桑椹胚胚胎里表達，轉錄組分析發現其中有27個表現出親本特異表達。這其中有13個可以在正常桑椹胚胚胎中通過單核苷酸多態（SNP）追蹤其轉錄的親本來源的基因。轉錄組數據表明這13個基因的轉錄都表現親本特異性，並且這種親本特異性依賴於父母本間差異H3K27me3修飾。通過過表達H3K27me3去甲基化酶Kdm6b去除H3K27me3可以消除這些基因轉錄的親本特異性。這些基因中包括所有四個已知的非典型印記基因。從而這些證據表明H3K27me3控制了非典型基因印記的建立與維持並且有更多非典型印記基因存在。

小鼠早期胚胎髮育過程中，H3K27me3介導的非典型基因印跡發生的過程。

最後通過追蹤更晚發育時期各個譜系裡非典型基因印跡的維持狀態，研究者發現非典型基因印跡在胚胎著床后的胚胎組織丟失，而在胚外胎盤組織維持（上圖）。這與典型基因印跡在胚胎與胚外組織都維持只在原生殖細胞中被擦除很不一樣。

總的來說，該研究揭示了一個新的基因印跡調控機理，並且鑒定了多個新的印跡基因。這些發現打開了研究非典型基因印跡相關研究這個新領域的大門，為更進一步理解基因印跡發生的機制及其功能奠定了堅實的理論基礎。

據悉，該論文主要由三位共同第一作者Azusa inoue、蔣嵐和陸發隆協作完成，Azusa inoue和蔣嵐目前是張毅實驗室博后，陸發隆博士目前已經回國在中科院遺傳發育所建立起了實驗室，併入選了第十三批「青年千人計劃」。

張毅教授

Comments：基因的轉錄是由識別DNA序列的轉錄因子（TF）和基因所處的表觀遺傳環境所共同調控的。轉錄因子對於其靶基因的表達是必要的，但不是充分的。這方面最好的例子就是基因印跡現象（genomic imprinting）。對於多數基因來說，來自於父親和母親的兩個等位基因具有相仿的轉錄活性，但在哺乳動物中有數百個基因的表達卻具有親本來源特異性，或者說有些基因只有來自於父親的那個拷貝才能表達，有些基因則相反。這些基因被稱為印跡基因（imprinted gene）。序列完全相同的兩個等位基因可以在同一個細胞里、存在著完全相同的轉錄因子的情況下擁有截然相反的轉錄活性，這表明轉錄因子的存在並不能完全決定其靶基因的表達。因此，這一現象成為了一個經典的表觀遺傳現象。

基因印跡現象的分子機制已經有了大量的研究，許多基因的印跡表達是由不同親本來源的等位基因調控區的差異性DNA甲基化造成的。然而，也已經觀察到有些印跡基因並不受DNA甲基化的調控，它們的調控機制尚不明朗。張毅實驗室的這篇文章報道的就是一個新型的印跡基因調控機制，組蛋白H3第27位賴氨酸的三甲基化（H3K27me3）。

基因表達的狀態與其染色質開放程度密切相關。去年，張毅實驗室發展了一種在少量細胞中測定染色質開放程度的技術，並測定了哺乳動物早期胚胎髮育過程中染色質開放程度的動態性，工作發表在Cell雜誌。利用這一技術，在本項研究中，他們進一步測定並分析了父源和母源基因組在早期胚胎中的染色質開放程度差異，發現了一些新的印跡表達基因。通過關聯性研究，他們發現其中部分印跡基因與DNA甲基化無關，而是和H3K27me3密切相關。通過干預H3K27me3，他們成功消除了這些基因的印跡表達現象，使兩個等位基因同時發生活躍轉錄。

這一工作在兩個方面非常出色，首先是工作的新意，發現了基因印跡的新型調控機制；然後是工作的遞進性，先通過描述性的測定工作找到父、母源基因組差異表達的新印跡基因，再通過關聯性研究發現其與H3K27me3的相關性，最後通過干預證明H3K27me3對這些印跡基因調控的因果性。即新穎又紮實，所以Nature以長文形式發表是很自然的事情。

最後，我還想說這項工作是和張毅實驗室在相關領域的長期系統性積累分不開。H3K27me3的甲基化酶是他實驗室首先報道的，他們後續在相關領域做出了一系列重要的工作，近年來他們在哺乳動物早期胚胎髮育過程中的表觀遺傳動態和機制方面也有多項重要的工作，現在發現H3K27me3對基因印跡的調控作用應該算是水到渠成吧。

參考文獻：

1、Barlow, D. P., & Bartolomei, M. S. (2014). Genomic imprinting in mammals. Cold Spring Harbor perspectives in biology, 6(2), a018382.

2、McGrath, J., & Solter, D. (1984). Completion of mouse embryogenesis requires both the maternal and paternal genomes. Cell, 37(1), 179-183.

3、Surani, M. A. H., Barton, S. C., & Norris, M. L. (1984). Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis. Nature, 308(5959), 548-550.

4、Barlow, D.P., et al., The mouse insulin-like growth factor type-2 receptor is imprinted and closely linked to the Tme locus. Nature, 1991. 349(6304): p.84-7.

5、 DeChiara, T.M., E.J. Robertson, and A. Efstratiadis, Parental imprinting of the mouse insulin-like growth factor II gene. Cell, 1991. 64(4): p. 849-59.

6、 Bartolomei, M.S., S. Zemel, and S.M. Tilghman, Parental imprinting of the mouse H19 gene. Nature, 1991. 351(6322): p. 153-5.

7、Wan, L. B., & Bartolomei, M. S. (2008). Regulation of imprinting in clusters: noncoding RNAs versus insulators. Advances in genetics, 61, 207-223.

8、Lee, J. T., & Bartolomei, M. S. (2013). X-inactivation, imprinting, and long noncoding RNAs in health and disease. Cell, 152(6), 1308-1323.

9、Okae, H. et al. Re-investigation and RNA sequencing-based identification of genes with placenta-specific imprinted expression. Hum. Mol. Genet. 21,548–558 (2012).

10、 Okae, H. et al. RNA sequencing-based identification of aberrant imprinting in cloned mice. Hum. Mol. Genet. 23, 992–1001 (2014).

11、Umlauf, D. et al. Imprinting along the Kcnq1 domain on mouse chromosome 7 involves repressive histone methylation and recruitment of Polycomb group complexes. Nat. Genet. 36, 1296–1300 (2004).

12、Lu, F., Liu, Y., Inoue, A., Suzuki, T., Zhao, K., & Zhang, Y. (2016). Establishing chromatin regulatory landscape during mouse preimplantation development. Cell, 165(6), 1375-1388.

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