運動神經元中FUS介導環狀RNA形成

3月30日，Nature Communication雜誌在線發表了羅馬薩皮安扎大學Mariangela Morlando教授和義大利技術研究所Irene Bozzoni教授為共同通訊作者的文章，介紹發現RNA結合蛋白FUS在神經元中介導RNA反向拼接活動，與環狀RNA的形成有關[1]。

FUS基因

FUS蛋白是一種RNA結合蛋白，已報道參與調控RNA的剪接作用。已有研究報道表明FUS基因的C-端突變會改變該蛋白的亞細胞定位，導致細胞核內減少而胞質能增多，形成聚集體，最終導致ALS等神經系統疾病。

本文的思路與結論

FUS是RNA結合蛋白，還參與RNA剪接作用，那麼FUS會不會參與神經系統的環狀RNA生成呢？本文正是圍繞這一問題開展的。作者採用體外分化的運動神經元作為研究對象，構建了FUS基因敲除株，分析了FUS基因敲除前後分化的運動神經元中環狀RNA的變大差異，結合對應線性RNA的變化比例和測序丰度，最終找出了19種環狀RNA，進一步在胚胎幹細胞和分化的運動神經元中分析其表達狀態，也在人的ES和運動神經元中進行了驗證。接下來，作者在Neuro-2a細胞中進行RNA干擾實驗和各種突變型誘導表達分析，最終證明FUS蛋白與環狀RNA的形成有關，FUS是通過結合外顯子/內含子邊界參與環狀RNA的形成過程的。

小鼠胚胎幹細胞（mES）誘導分化的運動神經元（MN）中環狀RNA表達情況

作者採用小鼠mES分化MN的模型進行該項研究，構建了FUS敲除株和分化后MN特異性GFP基因標記（Hb9::GFP，分化成功的運動神經元才能發出綠色熒光）。基於這一體外模型，比較了FUS敲除前後環狀RNA的變化情況，進行了三次生物學重複。

圖1 FUS基因敲除后運動神經元中環狀RNA表達發生變化（來自[1]）

FUS基因敲除改變環狀RNA表達狀況

在上述模型中作者分析了環狀RNA與所對應的線性RNA的變化情況，篩選到了136種有變化的環狀RNA，其中111種為下調。但這其中有兩個環狀RNA的線性RNA變化也非常明顯，這種改變可能是轉錄水平的改變引起的，因此接下來的分析中將其暫時排除。剩下的134種環狀RNA再依據表達量的狀況，過濾掉在6組測序樣品數據中Reads少於2個的，這樣剩下的是21種。然後經過RNase R消化實驗，又有兩種對RNase R敏感，也排除掉。剩下的19種環狀RNA進行了定量PCR驗證。作者在RT-PCR中也遇到了PCR產物有多條帶的情況，懷疑是滾換反轉錄的結果，於是挑選了兩個進行膠回收驗證，測序結果證明所推測的屬實。

圖2 篩選到的環狀RNA定量PCR驗證（來自[1]）

為進一步分析這些候選環狀RNA與運動神經元的相關性，作者繼續在mES和MN中分析了它們的表達情況，結果表明有的circRNA在mES中就有表達，有9種環狀RNA在分化的MN中明顯高表達。作者還在人的ES分化MN模型中進行了驗證實驗。

圖3 MN特異性的環狀RNA驗證（來自[1]）

FUS基因敲除或突變影響環狀RNA的生成

為進一步研究FUS與環狀RNA生成的關係，作者選用了Neuro-2a (N2a)細胞進行分子實驗。在N2a細胞中，19種環狀RNA只有一種沒有檢測到。通過分離細胞質和細胞核組分分析細胞定位，結果表明絕大部分環狀RNA定位於細胞質，但有3個是主要定位於細胞核內，這些定位於細胞核的環狀RNA對應的基因缺少內含子。

在N2a細胞中進行RNA干擾或構建誘導表達各種FUS突變型，分析FUS基因功能與環狀RNA的形成關係，結果表明FUS基因喪失或不能正確定位於細胞核內都會明顯降低環狀RNA的形成效率，這其中也包括ALS疾病相關的FUSR521C和FUSP525L突變型。

對於FUS干擾后表達降低的環狀RNA，兩種突變型均不能有有效的恢復其表達狀態，野生型FUS則可以。而對於那些FUS干擾後會升高的環狀RNA，兩種突變型與野生型均能降低其表達。兩種突變型會導致不能有效定位至細胞核中，這些結果說明FUS突變后與U1-70K的相互作用減弱，會影響一部分環狀RNA的生成效率。而即使非常少量的FUS蛋白進入細胞核（兩種突變型可以少量地位到核內），通過結合SMN也可以有效抑制一些環狀RNA相關的RNA剪接作用過程。作者也在人的ES細胞中驗證了這些實驗。

圖4 N2a細胞中各種FUS突變和干擾條件下環狀RNA 的表達情況（來自[1]）

FUS結合環化位點的外顯子/內含子交界處

作者通過重新分析已發表的小鼠大腦FUS蛋白CLIP-Seq的數據，分析所篩選到的134種環狀RNA的環化位點周圍結合情況，分析環化位點500nt的範圍。結果表明FUS敲除後有明顯變化的環狀RNA所對應的環化位點兩側的內含子中FUS結合的情況明顯高於不變化的環狀RNA。

圖5 FUS傾向於結合環化位點兩側的序列（來自[1]）

作者分別構建了受FUS敲除後上調和下調的環狀RNA的人工表達載體，模擬內源的環狀RNA形成過程，看FUS干擾前後對環狀RNA形成的影響情況，結果與預期一致，說明FUS確實是調控環狀RNA的形成過程的。

圖6 設計載體驗證FUS促進環狀RNA形成（來自[1]）

這篇文章的發現比較有意義，首先豐富了我們對神經系統環狀RNA形成機制的認識。神經系統是人體內環狀RNA最豐富的組織，這其中的環狀RNA是如何形成的還沒有完全研究清楚，本文的發現豐富了對該問題的認識。其次，本文首次報道了FUS基因疾病相關的突變與環狀RNA形成過程的關係，對於探索疾病相關特異性變化的環狀RNA形成機制提供了非常好的借鑒。

參考文獻：

1. Errichelli, L., et al., FUS affects circular RNA ex pression in murine embryonic stem cell-derived motor neurons. Nat Commun, 2017. 8: p. 14741.

文 | circRNA 吉賽生物

本文為作者授權肽度時界發布

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