肝細胞再生研究最新進展

2017年8月28日/

BIOON/---肝臟是身體內以代謝功能為主的一個器官，並在身體裡面起著去氧化、儲存肝糖、分泌性蛋白質的合成等作用。肝臟也製造消化系統中之膽汁。

在人體的所有器官中，肝臟的再生能力最為強大。至於肝臟如何進行自我修復及再生，專家學者們尚未得到統一的結果。一項新進研究揭示了一種不明細胞對肝臟再生具有重要意義，它可以使肝臟組織得以再生卻不會形成

。這些新發現的細胞也稱為肝細胞，但是它的功能比普通的肝細胞更強大。在既往研究中，研究人員認為肝臟中的一類成體

即卵圓細胞在肝臟的再生功能中發揮著重要作用，但是後續研究證實卵圓細胞最後分化為膽管細胞。基於此，小編針對肝細胞再生研究近年來取得的進展進行一番盤點，以饗讀者。

在一項新的研究中，來自英國愛丁堡大學、美國麻省理工學院和俄羅斯斯科爾科沃科技學院的研究人員首次證實膽管上皮細胞（cholangiocyte, epithelial bile duct cell）在肝臟再生中的作用。這一結果對

和抵抗肝臟疾病是高度有前景的。相關研究結果發表在2017年7月20日的Nature期刊上，論文標題為「Cholangiocytes act as facultative liver stem cells during impaired hepatocyte regeneration」。

肝臟是人體能夠再生的少數器官之一。當因創傷或慢性疾病而導致肝臟損傷時，主要的肝細胞，即負責所有基礎的肝臟功能的肝實質細胞（hepatocyte），通過分裂產生新的肝實質細胞而能夠再生。對執業醫師和科學家們而言，激活肝臟再生是一個急迫的問題，但是這種機制的細節和其他的肝細胞是否參與新的肝實質細胞形成過程仍然是不清楚的。

這些研究人員利用轉基因小鼠作為測試對象；為此，他們成功地模擬人體中常見的肝臟損傷。這項實驗是在兩個獨立的轉基因模式小鼠中開展的，在它們體內，肝實質細胞發生分裂的能力被有意地降低以便評估其他的肝細胞對再生的貢獻。結果表明膽管上皮細胞參與肝實質細胞再生。此外，他們指出源自膽管上皮細胞的肝實質細胞的再生潛力可能高於正常的肝實質細胞。

論文共同作者、斯科爾科沃科技學院轉化醫學中心副主任Yuri Kotelevtsev教授說：「一年多一點以前，我遇到了來自愛丁堡大學的同事，一起創建聯合科研項目。我告訴了他們在我們在斯科爾科沃科技學院的研究中心（在Victor Koteliansky教授指導下）里，我們如何成功地調整肝臟基因敲降（gene knockdown）技術。這種技術存在了大約7年的時間，但是它在體內的應用需要很高的實驗水平，而且仍然僅在幾個學術驗室中可以獲得。剛好Stuart Forbes教授的實驗室正在解決哪種基因敲降能夠快速地證實膽管上皮細胞在肝臟再生中發揮關鍵作用的假設的過程中存在的一個問題。斯科爾科沃科技學院和麻省理工學院的貢獻是我們構建和提供攜帶針對β1-整合素編碼基因的

的脂質

顆粒，這種siRNA在模式小鼠體內阻斷肝實質細胞中的這個基因的表達，而且隨後對模式小鼠表型的觀察結果允許鑒定出參與肝臟再生的膽管上皮細胞。當前，Forbes教授領導的蘇格蘭

中心正開始開展研究，旨在分離出自體膽管上皮細胞和將它們移植到到肝硬化患者體內。我們正在繼續與Forbes教授實驗室開展合作。我們測試新的靶基因，阻斷它們可能阻止與肝纖維化和隨後的肝硬化相關聯的過程或者讓這些過程穩定化。」

日大學部學家發現造成口臭(halitosis)的氣味難聞的化合物非常適合用於收集從人牙髓(dental pulp)中提取的

。2012年2月27日，這些研究結果發表在Journal of Breath Research期刊上。

在這項研究中，研究人員證實硫化氫(hydrogen sulphide, H2S)能夠增加

分化為肝細胞的能力，從而提高成體

作為未來肝細胞治療的一種可靠來源的名聲。這是第一次發現肝細胞能夠產自人牙髓，而且更讓人印象深刻的是，它們能夠大量生產同時保持高純度。

在這項研究中，Ken Yaegaki博士和來自日本齒科大學的同事們利用來自牙髓---牙齒的中央部分，由結締組織和細胞組成---的幹細胞進行研究，其中這些

是從正在接受常規拔牙的牙科患者的牙齒中獲得的。

一旦

被製備得足夠多，它們就被分成兩個批次(測試組和對照組)並且測試組細胞在H2S培養箱中孵育。在3天、6天和9天之後，它們分別被收集下來進行分析以便觀察這些細胞是否成功地轉化為肝細胞。

為了測試這些幹細胞在H2S影響下是否能夠成功地分化為肝細胞，研究人員進行一系列測試來研究

分化產生的細胞是否擁有肝細胞的典型特徵。除了在顯微鏡下的物理觀察之外，研究人員研究了它們儲存糖原的能力，並記錄了細胞中尿素含量。

Yaegaki博士繼續說道，「直到現在，沒有人發明出再生大量肝細胞用於人類移植的

。相比於利用胎牛血清生產肝細胞的傳統方法，我們的方法產率高，而且更為重要的是，它也更安全。」

在一項新的研究中，來自美國南卡羅萊納醫科大學和威斯康星醫學院的研究人員發現一種更好的方法純化利用誘導性多能

（ipsC）製造出的肝細胞。這一發現將有助研究肝臟疾病。相關研究結果於2016年8月25日在線發表在Stem Cell Reports期刊上，論文標題為「M

ing the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of

C-Derived Hepatocytes」。

傳統上抗體被用來識別細胞表面上的成熟特徵和純化相似的細胞。這種方法在

研究中是至關重要的，但是可購買的識別成熟肝細胞的抗體比較少，而且往往識別許多不同類型的細胞。在混合細胞群體中的很多細胞類型具有不同的特徵，從而可能會遮蓋住潛在的致病性的基因突變。

為了不依賴抗體，論文通信作者、南卡羅萊納醫科大學發育生物學家Stephen A. Duncan博士和同事們採取一種被稱作化學

細胞表面捕獲（chemoproteomic cell surface capture, CSC）的新技術。標記的細胞要比未標記的細胞具有更加類似的成熟肝細胞特徵。未發生分化的多能性

被排除在標記的細胞群體之中。

Duncan提醒道，迄今為止，移植利用

C產生的

還未準備轉化到診所臨床實踐當中。但是如今，這種分選同質的肝細胞的技術能夠被用來在

中成功地和準確地建立疾病模型和研究疾病。

軍事醫學科學院野戰輸血研究所獲悉，由該所王韞芳研究員、裴雪濤研究員帶領團隊取得了一項革命性研究成果——他們利用

技術，成功將人體胃上皮細胞轉變成多種潛能的內胚層祖細胞，後者可以被誘導分化為成熟的肝細胞、胰腺細胞和腸道上皮細胞等，為將來利用

治療終末期肝病、

等帶來新的希望。

2016年7月21日，國際著名學術期刊《細胞—

》雜誌在線發表了這一重要成果，覃金華、王術勇、張文成三位博士是該論文的共同第一作者。

近日，來自日本的科學家們發現成熟的肝組織中存在一類肝臟祖細胞是組織維持和損傷修復所需新生肝細胞的重要來源。該研究對肝損傷治療以及

研究都有一定意義。

研究人員發現一類與雙能肝臟

/祖細胞（LPC）不同的肝臟祖細胞，這類細胞能夠持續存在於小鼠肝臟，可能有助於組織的維持。一般來說科學家們分離EpCAM+細胞作為LPC，而肝臟祖細胞是CD45-TER119-CD31-EpCAM-ICAM-1+細胞群體中所富含的一部分細胞，這個複雜的細胞群體分離自妊娠晚期胎鼠和出生后胎鼠的肝臟。研究人員發現ICAM-1+肝臟祖細胞在出生后四周大量存在，雖然隨著年齡增長，這部分細胞的數目會逐漸下降，ICAM-1+肝臟祖細胞仍然會存在於肝臟中。

研究人員從1周和20周之間的小鼠肝臟中分離出ICAM+1細胞，建立了肝臟祖細胞克隆，他們發現這些克隆能夠高效地分化為成熟肝細胞，分化成熟的細胞能夠分泌白蛋白，清除銨離子，儲存糖原，並表現出細胞色素P450活性。即使進行長期培養，這些克隆仍然保持了分化形成成熟肝細胞的能力。當把ICAM-1+克隆移植到肝損傷和肝切除裸鼠模型體內，供體細胞能夠進入肝板，並表達肝細胞細胞核因子4α，C/EBPα以及氨基甲醯磷酸合成酶Ι等標誌性分子。

除此之外，經過短期的抑瘤素Μ處理，ICAM-1+克隆還能夠高效促進受體小鼠肝組織再生。

研究取得的進展使得在實驗室培養皿中能夠將病人的皮膚細胞轉化為心臟細胞、腎臟細胞和肝細胞等，這就給科學家們提供希望：有朝一日，這些細胞能夠替換

用於治療器官衰竭病人。但是將這些細胞成功地移植到病人的功能衰竭的器官中仍然是一個重要的臨床挑戰。

如今，來自美國加州大學舊金山分校和德國海德堡大學醫院的研究人員在小鼠體內證實在肝臟內產生健康的新的肝細胞是可能的，這就使得細胞移植是不必要的。更重要的是，他們是將肝臟內導致肝病的細胞（即肌成纖維細胞）轉化為健康的新的肝細胞，因而同時降低肝臟損傷和改善肝臟功能。論文通信作者、加州大學舊金山分校外科教授Holger Willenbring說，這一方法採用一種已在利用肝臟靶向基因療法治療病人中獲得早期驗證的病毒基因運送技術，這提示著它可能很容易進行臨床轉化，用於治療肝病患者。相關研究結果發表在2016年6月2日那期Cell Stem Cell期刊上，論文標題為「In Vivo Hepatic Reprogramming of Myofibroblasts with AAV Vectors as a Therapeutic Strategy for Liver Fibrosis」。

之前的研究已鑒定出基因調節蛋白混合物能夠將其他類型的細胞轉化為肝細胞，但是研究人員需要一種方法將這些指令運送到肌成纖維細胞中。在多年的研究后，研究人員鑒定出一種腺相關病毒（adeno-associated virus, AAV）亞型AAV6能夠特異地感染肌成纖維細胞。因此，研究人員著重關注AAV，這是因為已證實它在早前的人基因療法

中是安全的和有效的。

研究人員說，在培養皿中，這種病毒方法也高效地將人肌成纖維細胞轉化為功能性的肝細胞，但是還需要開展更多研究以便讓這種方法也能用於病人體內。特別地，Willenbring實驗室正在努力將這種方法中所使用的混合物包裝到單個病毒中，以便降低潛在的副作用和簡化臨床開發。該實驗室也正在努力將讓AAV6病毒對肌成纖維細胞的特異性變得更強，這是因為在當前的這項研究中，該病毒也能夠感染肌細胞和免疫系統中的一些細胞，不過不能將它們轉化為肝細胞，而且也不會明顯地影響它們的功能。

基因療法為治療

病提供希望，但是它的效率經常太低而沒有治療價值。如今，在一項新的研究中，來自美國俄勒岡健康與科學大學、斯坦福大學醫學院和貝勒醫學院的研究人員證實經基因修飾后對一種有毒藥物產生抵抗力的肝細胞能夠在活的小鼠體內選擇性增殖，從而高達1000倍地增加轉基因表達。這種新方法也可能用於骨髓、腸道、皮膚或腎臟組織中。相關研究結果發表在2016年6月8日那期Science Translational Medicine期刊上，論文標題為「A universal system to select gene-modified hepatocytes in vivo」。論文第一作者是來自俄勒岡健康與科學大學的Sean Nygaard。

在此之前，科學家們利用重組腺相關病毒（recombinant adeno-associated virus, rAAV）

治療血友病等肝臟疾病，取得一定的成功。然而，低劑量的病毒

通常並不導致高效轉導，高劑量病毒

能夠產生免疫反應，而且可能激活癌基因，這使得它成為一種有風險的治療方案。對已測試的一些疾病而言，經過基因修飾的肝細胞憑藉它們自己的力量在與有缺陷的肝細胞的競爭中勝出，但是對大多數肝臟疾病而言，情況並不是這樣的。

為了解決這些問題，Nygaard和同事們發現一種方法在小鼠體內選擇地擴增經過基因修飾的肝細胞。首先，他們構建出一種rAAV載體來運送旨在增加人凝血因子IV表達的轉基因。他們將一種讓肝細胞抵抗藥物CEHPOBA的短髮夾RNA（shRNA）插入到這種病毒載體中，其中shRNA抑制一種參與酪氨酸分解代謝中的關鍵酶--- 4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶（4-OH-phenylpyruvate dioxygenase），CEHPOBA是一種小分子的延胡索醯乙醯乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase）抑製劑。他們然後利用CEHPOBA或生理鹽水（作為對照）治療這些小鼠。他們報道，相比於對照小鼠，接受這種藥物治療的那些小鼠10～1000倍地增加它們體內的轉基因表達。

Nature雜誌最新在線的一篇研究中，Howard Hughes醫學研究所（HHMI）的科學家確定了能夠分化為功能性肝細胞的幹細胞。這項研究解開了關於肝臟不斷新生的細胞到底從何而來的老謎團。研究的通訊作者，斯坦福大學HHMI研究員Roel Nusse博士說:「我們解決了一個很老的問題.我們發現，就如同其他需要補充丟失細胞的組織，肝臟

也會增殖和產生成熟細胞，甚至在沒有肝損傷或疾病的情況下。」

幹細胞，能在補充保持自己數量的同時發展成高度分化的細胞，為皮膚，血液等組織在隨著時間丟失細胞的時候提供新的細胞。但是，在肝臟中還沒有發現過

的存在。一些科學家推測，成熟的肝細胞可能通過分裂保持其數量。但Nusse博士說，肝臟成熟的細胞已經高度分化，它們可能已經失去了分裂能力。「分化過的肝細胞染色體已經放大，」他解釋說，「這表明這些細胞的每一條染色體有超過兩個副本。這保證細胞能產生更多的蛋白質，不過確實會損害了它們的分裂能力。」

Nusse實驗室專註於一個稱為Wnts的蛋白質家庭，他們是幹細胞命運的關鍵調節子。通過尋找和跟蹤各種組織的幹細胞，他們已經開發出細胞響應Wnt信號後會發出熒光信號的小鼠。幾年前，他們決定用這種工程改造的小鼠來搜索肝臟中的幹細胞。研究人員通過搜索肝臟中的熒游標記，他們最終發現位於肝臟的中央靜脈周圍的幹細胞。在鎖定這些細胞后，研究人員繼續跟蹤了熒游標記的細胞的行為。這些細胞隨著時間的推移迅速分裂，不斷穩定地補充自己的數量。這個推測正確的可能性在於，不像成熟肝細胞，標記的細胞每個染色體只有兩個拷貝。在隨後一年中，科研人員發現這些標記的細胞發生改變，出現分化的細胞功能和成熟肝細胞擴增的基因組。這使得它們徹底符合了

的定義。

正如所料，肝幹細胞需要Wnt信號以保持它們幹細胞的身份。Nusse小組發現，正是中央靜脈內的血管內皮細胞釋放的Wnt分子進入組織。如果幹細胞遷移后跑出了Wnt信號的覆蓋範圍，它們便迅速失去了分裂新幹細胞的能力，開始發展成成熟的肝細胞。Nusse博士表示，這是已知的其他組織內

行為是一致的。

哥本哈根大學的研究者最近在elife雜誌上發表的文章揭開了早期胚胎細胞和胚胎

特異性分化為胰細胞和肝細胞的機制。

本項研究的負責人，Brickman教授說，這項新的發現幫助人們對於細胞發育的生理環境的重要性有了更深入的了解，使得我們在實驗室中能夠建立更優化的環境來誘導

和前體細胞分化成特定的成熟細胞。

處在發育過程中的細胞持續移動，在移動過程中它們組織並建立起類似於布滿道路的小城市一般的生理環境，這項新的研究成果揭示了兩個重要特性，首先，研究者發現胚胎細胞從其他細胞那裡接收信息來指導它們組織和建立生長通路，從而使這些胚胎細胞朝著早期胰細胞和肝細胞方向發育。其次，在這項報道中研究者們成功地將這些發育通路從發育中的

中分離出來並進行凍存。在隨後進行的另一項獨立實驗中，研究者使用這些經凍存復甦的生長通路來提高重要細胞生長信號缺失環境下細胞的正常發育和分化。

對於再生醫療的探索再現新進展。日本媒體報道稱，該國橫濱市立大學教授谷口英樹等人組成的研究小組使用誘導多能

（iPS細胞）成功制出能在老鼠體內發揮功能的小肝臟，為世界首例用iPS細胞培養的立體肝臟。這對以

等為主體的

研究發展有著重要意義。

這一成果被刊登在英國科學雜誌《自然》上，在此之前，現有的研究水平已經能夠用

細胞培養出肝細胞，但難以制出可在人體內發揮功能的立體結構肝臟。

細胞是誘導多功能幹細胞的簡稱，也就是體細胞經誘導因子處理後轉化而成的

，它能發育成各種組織和器官。

在iPS細胞的研究方面，日本一直予以重點關照。日本厚生勞動省的審查委員會在6月26日批准了利用此類細胞開展視網膜再生的臨床研究，成為世界上首個iPS細胞

。這也是在誕生六年後，

細胞向實用化所邁出里程碑意義的一步。

加利福尼亞大學聖地亞哥分校醫學院的研究人員發現，「混合肝細胞」是肝臟具有強大再生功能的根本原因。他們將研究結果發表在Cell。

將小鼠暴露於四氯化碳這種有毒環境下之後，研究人員密切關注著肝臟的修復過程。在肝臟的自我修復過程中，他們在肝門處發現了混合肝細胞。在肝臟出現慢性損傷之後，這些肝細胞廣泛進行增殖，對肝臟進行修復。由於這些細胞與正常的肝細胞相似，但表達出的基因為低水平的膽管細胞特異性基因，研究人員將它們稱為是「混合肝細胞（Hybrid hepatocytes,HybHP ）」。 研究人員對三組肝癌小鼠（各組小鼠患肝癌的類型不同）進行了評估和相應檢查，他們發現，並沒有證據證明混合肝細胞可以導致肝癌的出現和惡化。因此研究人員認為，混合肝細胞並不會引起肝病患者出現

。

儘管大多數的研究以小鼠為實驗對象進行，研究人員希望在人體中也可以找到人類的肝臟混合肝細胞，且人的混合肝細胞與小鼠的混合肝細胞的功能相似，都可以促使肝臟組織的再生和自我修復。我們相信，會有那麼一天，對於肝衰竭的患者，不需肝移植，只需細胞移植便可拯救患者生命。（生物谷 Bioon.com）