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微生物檢驗的基本操作技術匯總

2021/12/25

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一、無菌操作技術

1、定義

是指在執行實驗過程中，防止一切微生物侵入機體和保持無菌物品及無菌區域不被污染的操作技術和管理方法；

無菌操作技術是微生物實驗的基本技術，是保證微生物實驗準確和順利完成的重要環節。

2、內容

無菌操作技術主要包括兩方面：

1）創造無菌的培養環境。包括提供密閉的培養容器、培養容器的滅菌、培養基的滅菌等；

2）在操作和培養過程中防止一切其它微生物的侵入的措施。包括紫外線殺菌、甲醛熏蒸、超凈台的消毒與檢測、操作工具、器皿滅菌、操作方法等。

3、無菌操作原則

1）在執行無菌操作時，必須明確物品的無菌區和非無菌區，接種時必須穿工作服、戴工作帽，應在進無菌室前用肥皂洗手，然後用75%酒精棉球將手擦乾淨；

2）在操作前20～30分鐘要先啟動超凈台和紫外燈，進行接種所用的吸管、平皿及培養基等必須經消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應高壓滅菌或用95%酒精點燃燒灼3次后使用。嚴禁用手直接拿無菌物品，如瓶塞等，而必須用消毒的鉗、鑷子等；

3）從包裝中取出吸管時，吸管尖部不能觸及外露部位，使用吸管接種於試管或平皿時，吸管尖不能觸及試管或平皿邊；

4）接種樣品、轉種細菌必須在酒精燈前操作，接種細菌或樣品時，吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒；

5）接種環或接種針在接種細菌前應經火焰燒灼全部金屬絲，必須時還要燒到環和針與桿的連接處；

6）吸管吸取菌液或樣品時，應用相應的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。傾倒平板應在超凈台內操作，並且在開啟和加蓋瓶塞時需反覆用酒精燈燒。

二、無菌操作的環境要求

1、無菌室

（1）無菌室的結構：更衣間、緩衝間、操作間；

（2）無菌室的消毒和防污染

•每日（使用前）紫外線照射（0.5~1小時）；

•每月用新潔爾滅擦拭地面和牆壁一次的方式進行消毒；

•每季度用甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時），特殊情況下可增加熏蒸頻次。

（3）無菌室使用要求

①無菌室內應保持清潔，工作後用2%-3%煤酚皂溶液消毒，拭擦工作檯面，不得存放與實驗無關的物品；

②無菌室使用前後應將門關緊，打開紫外線，如採用室內懸吊紫外燈消毒時，需30W紫外燈，距離在1.0m處，照射時間不少於30min，使用紫外燈，應注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精棉球輕輕拭擦，除去上麵灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響；

③處理和接種食品標本時，進入無菌室操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過小窗傳遞。在無菌室內如需要安裝空調時，則應有過濾裝置。

2、超凈工作台

超凈台的使用與保養：

（1）風速穩定，且符合要求；

（2）使用前開啟紫外燈照射30分鐘以上；

（3）讓超凈台預工作10－15分鐘；

（4）使用完畢后，用70%酒精將檯面和台內四周擦拭乾凈。

3、無菌器材

（1）滅菌器材：玻璃器皿、培養基、無菌衣等；

（2）消毒器材：無菌室內的凳子、試管架、天平、工作台、手等。

（3）無菌間一般只允許放置無菌操作台、轉椅等物品；無菌操作台上一般只允許擺放以下物品：酒精燈、打火機、接種針、消毒棉球、洗耳球、鑷子、油性筆、滅菌平皿、試管架、滅菌吸管、電子天平、250ml滅菌三角瓶、培養基、均質器等。

三、無菌操作的基本技術

1、無菌接種操作

培養基經高壓滅菌后，用經過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）於培養基上，這個過程叫做無菌接種操作。

在實驗室檢驗中的各種接種必須是無菌操作。

2、微生物檢驗過程中的無菌操作要求

（1）在操作中不應有大幅度或快速的動作；

（2）使用玻璃器皿應輕取輕放；

（3）在正火焰上方操作；

（4）接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌；

（5）在接種培養物時，協作應輕、准；

（6）不能用嘴直接吸吹吸管；

（7）帶有菌液的吸管、玻片等器材應及時置於盛有5%來蘇爾溶液的消毒桶內消毒。

3、無菌操作技術詳細圖解

（1）取菌技巧

（2）接種技巧

（3）錯誤示範

微生物的接種、分離純化和培養技術

一、接種

1、接種定義

接種：將微生物接到適於它生長繁殖的人工培養基上或活的生物體內的過程叫做接種。

2、接種工具

在實驗室中，用得最多的接種工具是接種環、接種針。有時滴管、吸管也可作為接種工具進行液體接種。在固體培養基表面要將菌液均勻塗布時，需要用到塗布棒。

1．接種針 2.接種環 3.接種鉤 4.5.玻璃塗棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀

3、微生物檢驗常見接種方法

（1）劃線接種法

平板劃線分離法--分區劃線分離法

①用接種環先將培養物塗佈於平板1區並作數次劃線，再在2、3……區依次劃線；

②每划完一個區域，轉動培養皿約70度角，並將接種環滅菌一次，待冷后再劃下一區域；

③每一區域的劃線均接觸上一區域的接種線1～2次，使接種量逐漸減少，以獲得單個菌落；

④其他操作與上述曲線劃線分離法相同。

（2）斜面接種法

主要用於經劃線分離培養所獲得的單個菌落的移種，以及觀察細菌的某些培養特徵。

以菌種移種為例，其接種方法是：

① 取一菌種管和培養基管，置左手食指、中指、無名指間，拇指壓住兩管底部上側面，使菌種管位於外側，培養基管位於內側；

② 右手拇指和食指分別旋松兩管棉塞。火焰滅菌接種環；

③ 以右手小指與手掌，小指與無名指分別夾取棉塞（先外管后內管），將兩管口迅速通過火焰1~2次；

④將已滅菌的接種環伸入菌種管中，從斜面上取菌少許，迅速伸入待接種的培養基管中，在斜面底部向上劃一條直線，然後從底部起向上作曲折連續劃線，直至斜面上方頂端；

⑤取出接種環，火焰滅菌管口，塞上棉塞（先塞內管）；最後將接種環經火焰滅菌放好；

⑥做好標識，置35℃培養箱中培養18~24小時。斜面培養一般形成均勻一致的菌苔。一般可觀察表面、透明度、色澤等特徵。

（3）塗布接種法

塗布法接種是一種常用的接種方法，不僅可以用於計算活菌數，還可以利用其在平板表面生長形成菌苔的特點用於檢測化學因素對微生物的抑殺效應。

原理：將一定濃度，一定量的待分離菌液移到已凝固的培養基平板上，再用塗布棒快速地將其均勻塗布，使長出單菌落而達到分離的目的。

（4）液體接種法（肉湯接種）

①如斜面接種法持好菌種管及培養基管；

②滅菌接種環，從菌種管取菌，伸入培養基管中，在接近液面的管壁上方輕輕研磨，並沾取少許培養基液體調和，使細菌混合於培養基的液體中。液體培養基一般以18~24小時培養后觀察生長特徵。

肉湯培養可觀察如下幾項：

a.發育程度：有無生長、微弱、中等、旺盛；

b.混濁度：有無及程度（混、中等、微混、透明）、均勻混濁、有顆粒、絮狀生長；

c.沉澱：有無及量多少、性狀（粉狀、顆粒狀、絮狀、沾性）；

d.表面：有無生長、性狀（膜狀、環狀）、菌膜厚薄及表面特徵（光滑、顆粒、皺狀）；

e.其他：有無特殊氣味，色素。如果是糖發酵培養基則主要觀察是否產酸和有無氣體。

（5）穿刺接種法（半固體接種）

多用於保存菌種、觀察動力及厭氧培養等也可以用於觀察細菌的某些生化反應。

①如斜面接種法持好菌種管及培養基管；

②以滅菌接種針從菌種管取菌，垂直刺入培養基的中心（半固體或一般瓊脂高層）直達近管底部（但不能完全刺到管底），接種針應沿原路退出；

③經培養後半固體培養基可觀察到：沿穿刺線生長，線外的培養基清亮表示細菌無動力；穿刺線模糊不清，或沿穿刺線向外擴散生長，或整個培養基混濁表示細菌有動力。

二、分離純化

1、幾個定義

混和培養物：含有一種以上的微生物培養物稱為混和培養物（Mixed culture）；

純培養：如果在一個菌落中所有細胞均來自於一個親代細胞，那麼這個菌落稱為純培養（Pure culture）；

分離純化：在進行菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為純的培養物，得到純培養的過程稱為分離純化。包括傾注平板法、塗布平板法、平板劃線法等等。

2、傾注平板法（倒平板）

將無菌培養皿放入生物安全櫃或凈化台中，然後分別倒入15ml已融化並且冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基，加蓋后輕輕搖動培養皿，使培養基均勻分佈，待凝固之後，把這平板倒置在恆溫培養箱中培養。單一細胞經過多次增殖后形成一個菌落，取單個菌落製成懸液，重複上述步驟數次，便可得到純培養物。整個操作過程應嚴格按照無菌操作。