重大突破！北大鄧宏魁課題組實現成纖維細胞直接重編程

作為利用化學小分子誘導體細胞向可誘導多能幹細胞重編程領域的著名學者，北京大學鄧宏魁教授及其團隊近期又建立了一套完整可靠的小分子重編程方法[1]。

令人驚奇的是，在體細胞經化學小分子重編程為誘導多能幹細胞的過程中，細胞會經歷一種胚外內胚層樣細胞（Extra-Embryonic Endoderm-like state, XEN-like state）中間狀態[2]，通過對這一中間狀態細胞的詳細研究發現，胚外內胚層樣細胞能夠像多能幹細胞一樣分化成部分體細胞，如功能性神經元及肝臟細胞，也有望分化產生更多類型的體細胞，如此一來，在不經歷多能態(pluripotent state)下，從單一體細胞向多種體細胞的分化便成了現實。更難能可貴的是，胚外內胚層樣細胞在特定培養條件下能夠實現細胞命運的維持，在多次傳代后（大於20代），依然能穩定地保持胚外內胚層樣細胞主導基因（Sox17，Gata4，Gata6，Sall4）的表達和基因組穩定性，同時能夠像低代次胚外內胚層樣細胞一樣分化成為功能性神經元及肝臟細胞，因此以胚外內胚層樣細胞為平台，能夠實現細胞的大規模擴增，為臨床及科研供給不同類型的體細胞。

背景介紹

如何在體外獲得具有生理功能的體細胞對於再生醫學而言是個重要問題，近年來細胞系的重編程讓問題的解決看到了希望。化學介導的重編程更是獲得了眾多研究資源的青睞[3-5]。相比於傳統轉基因方法介導的重編程，化學方法解決了內源基因的修改所導致的潛在致突變及致癌風險，同時化學小分子兼具了細胞膜穿透性、可逆性、可控性和易於製造等諸多優點。

鄧宏魁教授課題組在近期獲得了鼠源體細胞向幹細胞狀態化學重編程的穩定方法，該方法的第一階段是將鼠源體細胞重編程為獨特的上皮型胚外內胚層樣細胞（epithelial XEN-like state），第二階段是進一步重編程為限定型胚外內胚層樣細胞（defined XEN-like state），因此研究人員可在第二階段穩定地獲取胚外內胚層樣細胞。

在這項研究中，研究人員試圖繞過幹細胞階段，通過胚外內胚層樣細胞產生特定功能的體細胞。通過對重編程小分子化合物組合的微調，獲得了穩定的神經元誘導方法。參照肝臟細胞誘導方法，肝臟細胞也能通過胚外內胚層樣細胞誘導產生。研究人員同時實現了胚外內胚層樣細胞命運的維持，在長時間培養及多次傳代的基礎上，保持了相關基因的穩定表達、細胞基因組的穩定性及分化可塑性，實現了胚外內胚層樣細胞的規模化量產。

結果

化合物的微調以獲得穩定的胚外內胚層樣細胞

根據已經發表的文獻，胚外內胚層樣細胞的原始克隆可在重編程的早期階段通過引入7種小分子化合物（VPA，CHIR99021，616452，tranylcypromine，forskolin，AM580，and EPZ004777；即VC6TFAE）獲得。TD114-2和CHIR99021均為GSK3-β抑製劑，然而TD114-2已被證明具有更強的作用[6]，在該實驗中，研究人員將CHIR99021替換為TD114-2后發現胚外內胚層樣細胞的原始克隆提高了3倍，但胚外內胚層樣細胞的主導基因（Sox17，Gata4，Gata6，Sall4）的表達並未受到影響（圖1 A-C），因此通過對化合物的微調，顯著地提高了從體細胞到胚外內胚層樣細胞的重編程效率。

圖1 化學誘導神經元的分化策略

A． 胚外內胚層樣細胞的相襯圖像和原始克隆的誘導效率（經TD114-2 組合或 CHIR 組合）；

B． 胚外內胚層樣細胞主導基因（Sox17，Gata4，Gata6，Sall4）的定量PCR分析（經TD114-2 組合或 CHIR 組合）；

C． 經TD114-2 組合誘導產生的原始克隆的免疫染色分析；

D． 胚外內胚層樣細胞重編程及神經元分化示意圖；

E． 不同初始細胞密度下，Tau-EGFP陽性細胞的誘導效率（經TD114-2 組合或 CHIR 組合）；

F． Tau-EGFP陽性細胞在進一步誘導前後的對比圖；

G． 成纖維細胞、Tau-EGFP陽性細胞和初級神經元的聚類分析；

H． 成纖維細胞、Tau-EGFP陽性細胞和初級神經元的基因表達熱圖.

由胚外內胚層樣細胞穩定地產生神經元樣細胞

Tau蛋白的表達可以作為神經元生成的標誌，因此研究人員製備了Tau-EGFP細胞系來實時監測神經元樣細胞的產生。研究人員綜合概括了不同的誘導生成神經元的實驗方案，確定了Forskolin, CHIR99021及Dorsomorphin（FCD）聯用的實驗思路（圖1 D），發現最早可於誘導的第4天出現Tau-EGFP陽性細胞，在誘導的第8-12天Tau-EGFP陽性細胞可佔比50%以上，繼續延長神經元誘導時間發現Tau-EGFP陽性細胞延伸出了軸突樣分枝，這一現象標誌著神經元的逐漸成熟（圖1 F）。且通過對成纖維細胞、Tau-EGFP陽性細胞及初級神經元陽性對照的轉錄組測序（RNA-seq）分析表明，Tau-EGFP陽性細胞的基因表達已經完全不同於成纖維細胞，但和神經元陽性對照極其相似（圖1 H）。以上結果證明，神經元樣細胞能夠通過胚外內胚層樣細胞誘導分化產生。

誘導產生的神經元樣細胞在基因表達上和初級神經元相似

為進一步探究這些誘導產生的神經元樣細胞（Tau-EGFP陽性細胞）的基因表達特徵，研究人員檢測了典型的泛神經元標誌物的表達，共免疫染色結果顯示，Tau-EGFP陽性細胞同時表達了包括 TUJ1, MAP2, NF-H 在內的軸突生長共表達神經特異性蛋白（extensive neurite growth co-expressed multiple neuronal-specific proteins）（圖2 A-E）。進一步實驗發現，當延長神經元誘導時間至18天，Tau-EGFP陽性細胞會共表達 vGLUT1蛋白（效率為80%），共表達 GABA蛋白（效率為5%），因此可以證明Tau-EGFP陽性細胞會進一步成熟為興奮性谷氨酸能神經元和抑制性GABA能神經元（圖2 F-G）。

誘導產生的神經元樣細胞的成熟及功能特性

為探究誘導產生的神經元的電生理特性，研究人員採用了全細胞膜片鉗技術（whole-cell patch-clamp），在電流鉗模式中，通過對細胞膜進行除極，12+12天誘導產生的Tau-EGFP陽性神經元產生了動作電位。在電壓鉗模式中，伴隨著電壓依賴性的鈉、鉀通道的開啟，Tau-EGFP陽性神經元產生了快速內向及外向的電流。以上實驗證明，胚外內胚層樣細胞可被誘導成為功能性神經元細胞。

為進一步促進誘導產生的神經元樣細胞的成熟，研究人員採用了與星形膠質細胞共培養的策略[7]，共培養后的神經元樣細胞展現了更為複雜的神經元形態，同時細胞膜電生理特性被進一步提升（圖2 I-K），而且自發性興奮性突觸后電流（EPSCs）也能被檢測到。令人激動的是，80%的Tau-EGFP陽性神經元同時表達了成熟神經元標誌蛋白NEUN（圖2 H）。此外，誘導產生的神經元的功能亞型也能被聚焦應用100mM谷氨酸引起的內向電流所確證（圖2 M）。

圖2誘導產生神經元的特徵分析

A-E．Tau-EGFP陽性神經元共表達泛神經元標誌物 [TUJ1 (B)，NF-H (C)，MAP2 (D) 和SYN (E)]；

F-H．Tau-EGFP陽性神經元共表達神經元功能亞型及成熟標誌物 [vGLUT1 (F)，GABA (G) 和 NEUN (H)]；

I． Tau-EGFP陽性神經元與星形膠質細胞共培養后的膜片鉗記錄；

J． Tau-EGFP陽性神經元動作電位的發放；

K． 電壓膜片鉗記錄了細胞的內向電流，且該電流可被河豚毒素所阻斷；

L． Tau-EGFP陽性神經元與星形膠質細胞共培養后可出現自發性興奮性突觸后電流；

M． 焦點應用100mM谷氨酸觸發內向膜電流；

N． 將Tau-EGFP陽性神經元向小鼠腦內移植的示意圖；

O-Q. 移植后的Tau-EGFP陽性神經元能夠存活並逐漸成熟，均為單核細胞，且能檢測到動作電位的發放.

移植入成年鼠大腦中誘導產生的神經元樣細胞的存活與成熟

為探究誘導產生的神經元的在體功能，研究人員將Tau-EGFP陽性神經元移植到成年小鼠（大於8周）的紋狀體中，移植4周后觀察發現，在注射部位能夠清晰地看到Tau-EGFP陽性神經元（圖2 N，O）。為進一步證明移植的細胞為外源性，研究人員通過對單一細胞中細胞核計數的方法研究了細胞與細胞融合的可能性[8]，結果顯示移植的Tau-EGFP陽性神經元均為單一細胞，均為單核形式且具有電生理功能（圖2 P-Q）。綜上所述，經胚外內胚層樣細胞誘導產生的神經元在體內同樣具有生理活性。

長期擴增的胚外內胚層樣細胞維持了基因組穩定性和神經元分化潛能

為進一步研究胚外內胚層樣細胞的特性，研究人員研究了胚外內胚層樣細胞的生長速率，發現其生長速率（約20小時細胞數量翻倍）比原始成纖維細胞的生長速率（約40小時細胞數量翻倍）快，但慢於胚胎幹細胞（約15小時細胞數量翻倍）（圖3 A）。經以 TD114-2為基礎重編程產生的胚外內胚層樣細胞能夠擴增至少20代（每3-4天傳代一次，消化成單細胞，以1:20-30比例傳代）（圖3 B-C）。儘管胚外內胚層樣細胞具有高度可擴增性，但該類細胞注入免疫缺陷小鼠（SCID）體內后證明其不具成瘤性。通過核型分析及基因組雜交分析表明，長期擴增的胚外內胚層樣細胞保持了基因組的完整性及穩定性，更為重要的是，保持了胚外內胚層樣細胞主導基因的表達及神經元分化潛能（圖3 C-L）。

由胚外內胚層樣細胞誘導產生肝臟細胞樣細胞

前期胚外內胚層樣細胞的分化方向主要集中於神經細胞（外胚層系細胞），那麼胚外內胚層樣細胞的分化可塑性是否僅局限於外胚層系細胞仍需進一步實驗證明。研究人員參考並改進了前人所用的肝臟細胞誘導方法[9]，發現無論是低代次還是高代次的胚外內胚層樣細胞均能在20天的誘導條件下產生肝臟細胞的典型形態。進一步研究證明，這些肝臟細胞樣細胞能夠表達細胞色素P450酶系，且免疫染色證明呈甲胎蛋白（AFP）及白蛋白（albumin）陽性。從功能水平而言，這些誘導產生的肝臟細胞樣細胞亦能有效分泌白蛋白及尿素。綜上，胚外內胚層樣細胞亦可分化成為肝臟細胞樣細胞（內胚層系細胞），證明了胚外內胚層樣細胞的可塑性強。

圖3 長期擴增的胚外內胚層樣細胞保持了基因組穩定性和分化潛能

A． 成纖維細胞、胚胎幹細胞及胚外內胚層樣細胞的細胞數量翻倍所用時間；

B． 2代及20代的胚外內胚層樣細胞的相襯圖像；

C． 20代的胚外內胚層樣細胞共表達胚外內胚層樣細胞主導基因（Sox17，Gata4，Gata6，Sall4）；

D． 胚外內胚層樣細胞的核型分析；

E． 不同代次的胚外內胚層樣細胞的染色體數目的分佈，n代表供檢測的細胞數；

F． 胚外內胚層樣細胞的基因組雜交分析；

G． 成纖維細胞與胚外內胚層樣細胞的全基因組表達熱圖；

H-I．由高代次胚外內胚層樣細胞誘導產生的Tau-EGFP陽性神經元表達了典型的神經元標誌物，且具有電生理活性；

J．不同代次的胚外內胚層樣細胞誘導產生的Tau-EGFP陽性神經元的分化效率；

K．不同代次的胚外內胚層樣細胞、初級神經元、腦細胞、成纖維細胞的聚類分析；

L．規模化擴增胚外內胚層樣細胞的示意圖.

研究意義

該項研究成功實現了由單一體細胞經重編程後分化為多種體細胞的重大突破，而不經幹細胞階段。在其中扮演中樞角色的胚外內胚層樣細胞不僅具有良好的可塑性、安全性，更能夠實現胚外內胚層樣細胞快速而持續的擴增和命運的維持。在幹細胞領域，幹細胞與祖細胞「乾性」的維持一直以來都是一個難點，這項工作要求研究人員既要保證可塑性細胞的快速生長以滿足未來的強大的臨床需求，也要保證可塑性細胞不向下游分化。為達到這個目的，研究人員需要修改或微調培養基組成，嘗試各種培養條件，需要付出大量的時間和精力。在該項研究中，鄧宏魁教授課題組成功實現了胚外內胚層樣細胞快速擴增與命運維持，這項研究無論是對於幹細胞科研領域還是再生醫學治療領域的意義都是深遠而重大的。

參考文獻

[1] Hou, P., Li, Y., Zhang, X., Liu, C., Guan, J., Li, H., Zhao, T., Ye, J., Yang, W., Liu, K., et al. (2013). Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by small-molecule compounds. Science 341, 651–654;

[2] Zhao, Y., Zhao, T., Guan, J., Zhang, X., Fu, Y., Ye, J., Zhu, J., Meng, G., Ge, J., Yang, S., et al. (2015). A XEN-like state bridges somatic cells to pluripotency during chemical reprogramming. Cell 163, 1678–1691;

[3] Xu, J., Du, Y., and Deng, H. (2015). Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell 16, 119–134;

[4] Zhang, L., Yin, J.C., Yeh, H., Ma, N.X., Lee, G., Chen, X.A., Wang, Y., Lin, L., Chen, L., Jin, P., et al. (2015). Small molecules efficiently reprogram human astroglial cells into functional neurons. Cell Stem Cell 17, 735–747;

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