中國科大熊偉教授：質譜技術讓神經化學進入單細胞時代

OFweek醫療網訊 世界上沒有兩片完全相同的葉子，細胞也是。然而，科學家們在進行現代生物學研究時，大多時候都考察的是細胞群體，而忽略了細胞異質性。

就拿神經細胞來說，大腦中有億萬個神經細胞，這些神經細胞在細胞形態，突觸連結，細胞結構，電生理以及生理功能上具有高度的多樣性。不同種類的神經細胞中，其基因組、蛋白組、化學分子組成、含量、代謝也都有著很大的差別。在直徑不到1毫米的一個很小的腦區，可能就存在幾十種甚至上百種完全不同的神經元以及膠質細胞類型。甚至很多情況下，即使物理距離上相鄰的兩個神經元也可能是兩個不同的神經元類型。因此，對腦內單個神經元的基因組、蛋白質組以及代謝組進行分析，具有重要的生物學價值。

單細胞技術在近年發展非常迅速，比如單細胞測序，已經廣泛應用於各種生命學科的研究。2014年1月Nature Methods上發表的年度特別報道，將「單細胞測序」（Singled out for sequencing）的應用列為2013年度最重要的方法學進展。

單細胞技術不僅在測序方面取得了極大進展，單細胞質譜分析也正在逐漸得到更多的關注。與用於分析單個細胞基因組的單細胞測序不同，單細胞質譜主要是研究單個細胞內的代謝物情況，例如化學小分子的組成、含量和代謝等等。單細胞質譜的優勢在於可以高通量檢測目前其它單細胞技術無法檢測的小分子化合物，以及它們的代謝過程。同時，由於質譜本身的優勢，不需要採取測序或者特異性抗體等外部手段，就可以精確分析檢測到的化學物質信息，可以說是「物美價廉」。 不過，由於質譜技術本身的局限性，目前還無法做到類似單細胞測序那樣的大規模測量。

多學科交叉合作，開發單神經細胞質譜

2013年，熊偉教授結束了在美國國立衛生研究院的博士后研究工作，回國后加入了科學技術大學生命科學學院。在申請中組部「青年千人計劃」時，熊偉教授認識了另一位中科大化學學院的「青千」黃光明教授，當時，黃光明教授課題組正在發展一種小樣品（pL級別）質譜測量技術。經過多次討論，他們決定將兩個實驗室的優勢技術進行結合，開發單神經細胞質譜這一新技術。

目前質譜技術在神經科學中的應用，主要還是採用對大量組織細胞勻漿后的樣品進行分析。在單細胞檢測中，質譜分析因為具有高靈敏度，大的線性範圍以及高通量分析化學分子的特點，逐漸被用於單細胞的細胞代謝分析。但目前的方法需要使用大量有機試劑對細胞進行處理，無法保持採樣時細胞的活性；冗長的處理和分離過程也導致較慢的分析速度，無法短時間內完成大量單細胞分析；並缺乏來自同一細胞的電生理信號；最終導致單細胞代謝物的質譜分析無法大規模用於神經細胞的分析。

新技術讓質譜分析活體單個神經元成為現實

2017年1月26日，熊偉教授與黃光明教授等人在PNAS上發表了一項題為「Single－neuron identification of chemical constituents， physiological changes， and metabolism using mass spectrometry」的研究。在這項新研究中，研究團隊依託電生理膜片鉗以及電噴霧離子源技術建立了一種穩定的單神經元胞內組分取樣和質譜組分分析技術。

膜片鉗與單細胞質譜分析聯用技術分析單個神經細胞示意圖

電生理膜片鉗能將玻璃微電極接觸並吸附在細胞膜上，高阻抗封接后將膜打穿成孔，記錄膜片以外部位的全細胞膜的離子電流。而電噴霧技術主要是利用一個高壓交流電使分析物被離子化然後被質譜檢測，該離子源具有較強的抗干擾能力。與傳統的質譜方法相比，這一新方法最大的優勢是可以原位對活細胞進行取樣，並且同時採集細胞位置、電生理活動以及細胞內化學成分等多方面的信息。

質譜分析讓神經化學研究進入單細胞水平

研究人員利用這一方法對小鼠海馬、前額葉、杏仁核、紋狀體等腦區單個神經元內的數千種化學小分子進行了快速質譜檢測，並同步採集了電生理信號。

海馬、前額葉、杏仁核、紋狀體這四個核團無論是在人類還是低等動物中都非常重要，與學習、記憶和情緒等行為以及相關疾病如阿爾茨海默病、帕金森病等有著密切的聯繫。這些核團內的神經元種類繁多，目前國內外有多個課題組正在從單細胞測序的角度解析這些核團的神經元分類及對其功能進行鑒定。熊偉教授表示，他們對這四個核團神經元進行質譜研究，也正是想從單細胞水平全面分析這些核團神經元的代謝組學情況，以及這些代謝通路和代謝組在學習、記憶和情緒等行為及其相關疾病中的作用機制。

在這項研究中，研究人員主要對不同年齡段的小鼠海馬、杏仁核、紋狀體等腦區單個神經元中的谷氨醯胺（Gln）、谷氨酸（Glu）以及GABA等化學小分子進行定性、定量分析並對其進行神經元分類。

Glu和GABA是中樞神經系統兩大類神經遞質（興奮性或抑制性）的代表性分子。早期人們認為一個神經元內只存在一種遞質，其全部末梢只能釋放同一種遞質，這被稱之為戴爾原則（Dale＇s principle）。然而隨著科學技術的發展，人們逐漸認識到兩種或兩種以上遞質（包括調質）可存在於同一神經元內，在適當的刺激下可經突觸前膜共同釋放。這種新的觀點得到了眾多電生理及免疫組化等實驗的證明。然而這些證據大部分都是間接的證據，尚無直接證據表明二者的共存。這項研究首次在單細胞水平，通過質譜分析給出了二者共存於同一神經元內的直接證據。同時，研究人員還發現了一些尚未在神經系統中被發現的小分子，他們正在努力研究其作用和分子機制。

此外，研究還鑒定了單個神經元內谷氨醯胺的代謝路徑。Gln－Glu－GABA通路是谷氨酸和GABA代謝的經典通路，尤其是谷氨酸，它不僅僅作為興奮性神經遞質存在於神經元內，還大量參與到蛋白質的合成代謝以及細胞能量供應體系中。而GABA是中樞神經系統的抑制性遞質，可以防止神經細胞過度興奮。二者與各種腦疾病都有著密切的關係，如自閉症、阿爾茨海默病、帕金森病等。該通路在大腦的發育和衰老中扮演著非常重要的角色。對單個神經元內谷氨醯胺的代謝路徑的鑒定對於深入理解這條代謝通路以及與之相關的疾病機制具有重要意義。

這項研究首次利用化學質譜方法直接無稀釋地檢測單個神經元中多種神經遞質、代謝物、脂質等化學小分子，對單個神經元化學成分及代謝物進行了即時分析，並將目前神經細胞成分分析的研究推向了一個活細胞及單細胞水平。這一技術在將來或許能夠幫助科學家們在單細胞層次上去研究神經生物學、代謝組學、毒理學等生命科學的重大問題。

談到臨床應用前景時，熊偉教授的態度也十分肯定。他表示，該技術允許研究人員對血液、腦脊液等樣品中的單個細胞進行質譜檢測，結合相應的生物標記物，完全有可能對阿爾茨海默病、帕金森病、抑鬱症等神經精神疾病的早期診斷提供幫助。

後記

熊偉教授從事神經科學研究，他認為現代神經科學研究需要技術的快速研發以及多領域多學科的交叉合作，必須發展包括顯微成像、分子示蹤、質譜分析、光遺傳學以及轉基因操作等最新的生物、物理、化學與工程材料等多學科交叉技術。熊偉教授表示，對他而言，科研不僅僅是工作，也是興趣，尤其是對新技術的熱切追求，驅動著他不斷前行。熊偉教授及其研究團隊也正在和科大的其它實驗室展開合作，和不同的領域的科學家交流和分享科研心得是一種享受。

關於研究人員

該項工作由中科大生命學院博士后朱洪影、生命學院博士研究所鄒桂昌、王寧在熊偉教授和黃光明教授的共同指導下完成。該研究工作得到了國家自然科學基金委重大研究計劃、科技部、中科院戰略性先導科技專項（B類）以及國家青年千人計劃等的資助。該工作還得到科學技術大學同步輻射實驗室光電離質譜線站的儀器與技術支持。

關於熊偉教授

國家中組部「青年千人計劃」獲得者，2001年畢業於北京大學生命科學學院，獲理學學士學位。2006年畢業於北京大學生命科學學院，獲理學博士學位。2006至2013年，在美國國立衛生研究院（NIH）酒精濫用與酒精中毒研究所（NIAAA）做博士后研究工作。2013年3月加入科學技術大學生命科學學院。中科院腦科學與智能技術卓越創新中心骨幹成員。中科大神經退行性疾病研究中心暨腦資源庫核心成員。長期從事與神經化學、藥理學、小分子藥物研發相關的神經科學研究，運用多種先進的實驗技術從分子、細胞水平、到動物行為進行了深入系統的研究，並取得了系列重要成果。研究工作發表在Nature Neuroscience， Nature Chemical Biology， Journal of Experimental Medicine， PNAS， Journal of Neuroscience， Molecular Pharmacology等國際學術期刊上。獲得過多項國家級基金資助。