單細胞表觀多組學測序技術取得新進展

2017年6月16日，北京大學生命科學學院生物動態光學成像中心湯富酬課題組在《Cell Research》雜誌在線發表了題為「Single-cell multi-omics sequencing of mouse early embryos and embryonic stem cells」的研究論文。在國際上率先發展了對一個單細胞同時進行染色質狀態、DNA甲基化、基因組拷貝數變異、以及染色體倍性的全基因組測序技術（single-cell COOL-seq），並採用這一技術在單細胞解析度上系統、深入地解析了小鼠著床前胚胎髮育過程中表觀基因組重編程的關鍵特徵，以及染色質狀態與DNA甲基化之間的互動關係。

現有的基於高通量測序來分析全基因組染色質狀態的研究方法通常需要大量細胞（例如ATAC-seq、DNase-seq、FAIRE-seq、MNase-seq等）。即使這些方法可以做到單細胞解析度，也無法在單細胞解析度上對多種組學之間的互動關係進行研究。而湯富酬課題組將NOMe-seq（全基因組核小體定位及DNA甲基化組測序）技術和PBAT-seq技術（全基因組重亞硫酸鹽測序）巧妙地結合起來（圖1），並進行了系統的優化和提高，實現了對同一個單細胞進行多達5個層面的基因組和表觀基因組特徵的分析。

圖1: single-cell COOL-seq原理圖

該課題組利用這一新建立的scCOOL-seq方法，在單細胞解析度系統地描繪了小鼠著床前胚胎髮育過程中表觀基因組多個層面的動態變化。該項研究發現：

（1）受精后12小時以內，來自高度特化的卵細胞和精子的雌雄原核就經歷了大規模的基因組去甲基化。在此過程中，父母源基因組的染色體狀態迅速打開，在受精卵的原核期就已經達到高度開放的狀態，隨後在受精卵晚期染色質開放程度大幅度回落，並在2-細胞階段之後開放程度再次逐步增加，到囊胚期時達到最高點（圖2）。

圖2：小鼠著床前胚胎髮育過程中基因組內源DNA甲基化（A）與染色質狀態（B）以及染色質狀態異質性（基因啟動子區域；Homogeneously open、Divergent、Homogeneously closed三種異質性狀態）（C）（D）的動態變化

（2）首次在單細胞解析度系統分析了小鼠著床前胚胎髮育過程中染色質狀態的異質性。該研究發現在受精后12個小時以內受精卵中大部分基因的啟動子區域就由均勻關閉狀態迅速重編程為均勻開放狀態，為合子基因在隨後的轉錄做好準備（圖2）。

（3）首次在單細胞解析度證明持續轉錄對於維持早期胚胎中大部分基因的啟動子處於開放狀態是必需的，染色質狀態開放和轉錄活動互相促進，共同維持合子基因的穩定表達（圖3）。

圖3：轉錄對染色質開放狀態的維持以及轉錄因子對染色質開放區域的調控作用

（4）研究發現多能性核心因子Oct4的靶基因結合位點在4-細胞階段就處於開放狀態，遠早於真正建立多能性的囊胚期，暗示這些位點作為潛在的順式調控元件可能參與了早期胚胎細胞的命運決定過程。

（5）首次在單個細胞內對父母源基因組的染色質狀態以及DNA甲基化進行了深入分析。研究發現，受精后染色質狀態和DNA甲基化進行了不同步的重編程過程，父母源基因組的染色質狀態快速重編程、在每個單細胞中迅速達到精確平衡並一直維持。而DNA甲基化的重編程要慢一些並在父母源基因組之間維持不對稱分佈（圖4）。

圖4：小鼠著床前胚胎髮育過程中父母源基因組DNA甲基化的不對稱分佈

（6）首次在單細胞解析度解析了雌性胚胎細胞中父母源X染色體的DNA甲基化和染色質狀態重編程過程的異同。研究發現受精后，在雌性胚胎中失活的父源X染色體其DNA甲基化重編程速度要明顯慢於活躍的母源X染色體，二者之間DNA甲基化的差異一直到囊胚晚期才逐漸消除；而雌性胚胎中父母源X染色體同步進行快速的染色質狀態重編程，並在整個植入前時期維持這一父母源X染色體之間染色質狀態的精確平衡（圖5）。

圖5：小鼠著床前雌性胚胎單個細胞中父母源X染色體的DNA甲基化和染色質狀態的動態變化

（7）首次在單細胞解析度揭示了小鼠植入前胚胎髮育過程中表觀基因組的異質性。受精后，啟動子區域DNA甲基化異質性強烈的基因和染色質狀態異質性強烈的基因分別是兩類不同的基因。這暗示在小鼠著床前胚胎髮育的過程中，染色質狀態異質性和DNA甲基化異質性可能分別受不同機制的調控。

（8）首次在單細胞解析度將細胞周期與染色質狀態聯繫了起來，準確推斷出每個單細胞的倍性和細胞周期階段，並發現小鼠著床前胚胎在體內發育過程中和胚胎幹細胞使用了基本相同的一組DNA複製起始位點。

圖6: 小鼠著床前胚胎DNA甲基化和染色質重塑特徵示意圖

該研究系統地描繪了高度特化的配子在受精后重編程到具有發育全能性的受精卵、以及進一步發育成多能性胚胎的過程中，DNA甲基化和染色質狀態發生的精準、有序的變化，各個組學層面之間的互動關係，以及父母源基因組在著床前胚胎髮育中DNA甲基化和染色質狀態的重編程過程（圖6）。該工作為今後人們繼續研究哺乳動物早期胚胎細胞全能性和多能性的開啟奠定了基礎，同時為體細胞克隆效率的提高以及早期胚胎髮育異常的診斷與治療提供了新思路。

北京大學生命科學學院BIOPIC中心的博士后郭帆博士（現為四川大學研究員）、博士生李琳、李靜云為該論文的並列第一作者；北京大學生命科學學院湯富酬研究員和四川大學郭帆研究員為這篇文章的共同通訊作者。該研究工作由北京大學和四川大學共同合作完成，並且得到了國家自然科學基金委員會、北京未來基因診斷高精尖創新中心，以及北大-清華聯合中心的資助。

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