近期蛋白質組研究進展

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蛋白質組（Proteome）的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一個基因組，或一個細胞、組織表達的所有蛋白質。 蛋白質組的概念與基因組的概念有許多差別，它隨著組織、甚至環境狀態的不同而改變。 在轉錄時，一個基因可以多種mRNA形式剪接，一個蛋白質組不是一個基因組的直接產物，蛋白質組中蛋白質的數目有時可以超過基因組的數目。 蛋白質組學(Proteomics)處於早期「發育」狀態，這個領域的專家否認它是單純的方法學，就像基因組學一樣，不是一個封閉的、概念化的穩定的知識體系，而是一個領域。

蛋白質組學集中於動態描述基因調節，對基因表達的蛋白質水平進行定量的測定，鑒定疾病、藥物對生命過程的影響，以及解釋基因表達調控的機制. 作為一門科學，蛋白質組研究並非從零開始，它是已有20多年歷史的蛋白質(多肽)譜和基因產物圖譜技術的一種延伸. 多肽圖譜依靠雙向電泳(Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)和進一步的圖象分析；而基因產物圖譜依靠多種分離后的分析，如質譜技術、氨基酸組分分析等。

基於此，谷君針對近年來蛋白質組研究取得的最新進展，進行一番梳理，以饗讀者。

1.Science：重大突破！首次繪製出人蛋白質組亞細胞定點陣圖
doi:10.1126/science.aal3321

圖片來自Human Protein Atlas。

在一項新的研究中，對人細胞中的蛋白是如何分佈的首個分析結果揭示出大部分人蛋白能夠在一個給定的細胞中的一個以上位置發現到。利用位於瑞典的細胞圖譜（Cell Atlas），研究人員研究了人蛋白質組（對應著絕大多數蛋白編碼基因）的空間分佈，而且他們史無前例詳細地描述了蛋白在多個細胞器和細胞亞結構中的分佈。相關研究結果於2017年5月11日在線發表在Science期刊上，論文標題為「A subcellular map of the human proteome」。

這項研究是由瑞典皇家理工學院副教授Emma Lundberg領導的。Lundberg及其團隊產生了30多萬張圖片來系統性地確定人蛋白在體外培養的細胞系中的空間分佈，並且在單細胞解析度上將它們定位到細胞區域和亞結構中。

這種細胞圖譜是人類蛋白圖譜（Human Protein Atlas）計劃10多年研究的結果，它是在2016年12月發起的。這項新的研究詳細地分析了這幾十萬張圖片。這些圖片是作為一項國際合作行動的一部分產生的。這個國際合作行動也包括來自、韓國、印度、丹麥和德國的研究團隊。

這些研究人員將由13,993種抗體靶向的總共12,003種蛋白定位到30個細胞區室和亞結構中的一個或多個，此外，他們還詳述了13個主要細胞器的蛋白質組。具有最大蛋白質組的細胞器是細胞核（有6,930種蛋白）及其亞結構（如核小體和核小斑點），和細胞質（有4,279種蛋白）。

2.科學家建立世界上首個蛋白質組規模的健康人尿蛋白定量參考範圍可用於健康狀態監測及腫瘤篩查
doi:10.1016/j.ebiom.2017.03.028

液是臨床檢驗中除血液外最常用的體液樣本。從尿液中尋找新的生物標誌物，是當前臨床蛋白質組學研究的熱點之一。但由於尿蛋白質組的生理波動性和個體間差異很大以及缺乏在健康人群中對這些波動性和差異的長期監測和系統性評估，致使基於尿蛋白的生物標誌物研究的假陽性發現很高，基本無法通過後續的大規模臨床驗證。5月2日，國家蛋白質科學中心（北京）秦鈞課題組在EBioMedicine雜誌上發表了題為「Proof-of-Concept Workflow for Establishing Reference Intervals of Human Urine Proteome for Monitoring Physiological and Pathological Changes」的研究論文。

文章第一作者為冷文川副研究員，該研究以國際兩中心的方式採集了來自167名健康自願者的500個尿蛋白質組數據，對健康人尿蛋白質組的生理波動性和個體間差異進行了系統性評估，在此基礎上建立了世界上首個蛋白質組規模的健康人尿蛋白定量參考範圍。通過利用此定量參考範圍對跨大陸飛行及腫瘤病人尿蛋白質組數據進行分析的實例，充分展示了健康人尿蛋白定量參考範圍在健康監測及腫瘤篩查方面重要應用價值。

3.Cell：重磅！史上首次定量檢測完整的人類蛋白質組
doi:10.1016/j.cell.2016.06.041

在一項新的研究中，來自瑞士蘇黎世聯邦理工學院（ETH Zurich）和美國系統生物學研究所等機構的研究人員開發出人類SRMAtlas（Human SRMAtlas），即靶向識別和可重複地定量預測的人類蛋白質組中所有蛋白質的高度特異性質譜檢測方法彙編目錄，包括許多剪接變異體、非同義突變和翻譯后修飾。利用一種被稱作選擇性反應監控（selected reaction monitoring, SRM）的技術，研究人員利用166174種已被充分了解的化學合成蛋白特徵性肽（proteotypic peptide）開發出這些檢測方法。相關研究結果發表在2016年7月28日那期Cell期刊上，論文標題為「Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome」。論文第一作者為來自美國系統生物學研究所的Ulrike Kusebauch博士。論文通信作者為來自美國系統生物學研究所的Robert Moritz教授和來自瑞士蘇黎世聯邦理工學院的Ruedi Aebersold。

SRMAtlas資源在http://www.srmatlas.org網站上可以免費獲取，將有助於公平地開展重點的、假設驅動的和大型蛋白質組規模的研究。研究人員期待這一資源將極大地加快基於蛋白質的實驗室生物學發展從而有助理解疾病轉化和健康軌跡，這是因為如今在理論上能夠鑒定和定量檢測出任何樣品中的任何人類蛋白。

能夠可靠地和可重複性地檢測任何組織或細胞類型的人類蛋白質組中的任何一種蛋白在理解系統層次的性質以及正常生理下和患病時的特異性途徑方面引發變革。在Moritz教授實驗室中，研究團隊能夠利用SRM方法產生並驗證了一種由高度特異性地靶向蛋白質組檢測方法組成的彙編目錄，而且通過這種廣泛獲取的、靈敏的和強健的靶向質譜方法SRM，能夠定量檢測20,277種已被標註的人類蛋白中的99.7%。這種人類SRMAtlas提供明確的檢測坐標來確定性地鑒別生物樣品中蛋白質特徵性的肽。

4.Science：對肝臟線粒體功能進行系統蛋白質組學研究
doi:10.1126/science.aad0189

科學家們通過對小鼠開展大規模蛋白質組學研究獲得脂肪和能量代謝的分子遺傳背景方面的新認識。蛋白質組是一種生物體或某一種細胞、一種組織的基因組所表達的全部蛋白。在一項新的研究中，由瑞士聯邦理工學院教授（ETH Zurich）Ruedi Aebersold領導的一個專門從事蛋白質組學研究的團隊和由瑞士洛桑聯邦理工學院（EPFL）教授Johan Auwerx領導的一個專門從事於線粒體生理學與肝臟疾病研究的團隊合作開展這項突破性的研究項目。就這項研究而言，蛋白質組指的是小鼠肝臟中表達的全部蛋白。相關研究結果發表在2016年6月10日那期Science期刊上，論文標題為「Systems proteomics of liver mitochondria function」。

研究人員將來自一個大型小鼠群體的綜合性蛋白數據彙集在一起，從而有助他們解釋額外的代謝差異。他們採用一種被稱作SWATH-MS的質譜測量技術，這種技術是由ETH Zurich的Aebersold團隊最近開發出來的。它允許研究人員測量這種實驗性小鼠肝臟中一系列蛋白的濃度。

研究人員研究的一群小鼠是由40種小鼠品系組成的，這些小鼠品系可追溯到兩個相同的祖先，因此彼此之間的親緣關係比較密切。由來自這些10種小鼠品系的代表性小鼠組成多組相同的小鼠，給它們餵食高脂肪食物（即人們所述的垃圾食品）或健康的低脂肪食物。在幾周之後，他們記錄了這些小鼠的常規醫學（生理學）數據，尤其是測試了它們的表現和它們如何快地通過身體活動降低它們的體重。正如研究人員期待中的那樣，這些小鼠對高脂肪食物攝入作出不同的反應。一些小鼠患上代謝疾病，如脂肪肝，但是其他小鼠則不會如此。

為了進行評估，研究人員將這些生理學數據與基因組、轉錄組和蛋白質組數據結合在一起。從這些結合的數據中，他們能夠更加準確地描述幾種特定的蛋白在脂肪和能量代謝中的作用。其中一種蛋白是COX7A2L。他們發現，在小鼠體內，這種蛋白負責形成在線粒體---細胞內部的能量工廠---中發現的超級蛋白複合體（supercomplex）。這種超級蛋白複合體由100多種不同的蛋白組成，負責以合適的形式給細胞提供所需的能量。具有太少COX7A2L蛋白的小鼠不能夠提供足夠數量的所需能量，因而給整個有機體帶來負面影響。

5.芝加哥大學趙英明教授課題組Chemical Reviews撰文系統歸納組蛋白密碼定量蛋白質組學
doi:10.1021/cr500491u

近日，芝加哥大學趙英明教授課題組在國際頂尖化學期刊《Chemical Reviews》(影響因子45.661)上發表題為"Quantitative Proteomic Analysis of Histone Modifications"的論文，系統、深入地總結了當前組蛋白密碼定量蛋白質組學研究前沿成果，並詳細歸納了20種共四百多個組蛋白密碼。其中，趙英明教授課題組率先發現其中一半組蛋白密碼，是目前國際上發現組蛋白密碼最多的研究團隊。

組蛋白密碼蘊含了基因序列和生物個體性狀間的關鍵調控信息。它動態地調節染色質的結構和功能，極大擴展了傳統遺傳密碼的信息含量。定量蛋白質組學由於可檢測蛋白質定量變化而日益被廣泛應用到組蛋白密碼動態研究中。目前已發現組蛋白密碼異常與多種重大疾病密切相關，因此發現全新組蛋白密碼，以及研究組蛋白密碼動態變化對基因功能的調節機制，對深入了解疾病的發生機理、靶向性藥物開發乃至個體化治療等都有著極其重要的意義。

本論文系統歸納了利用生物質譜和定量蛋白質組學來解決組蛋白密碼研究領域問題的策略、技術及進展，並擴展了此方法在多個方面的應用，如：全細胞非組蛋白修飾的鑒定、蛋白質修飾調節酶的底物鑒定、蛋白質修飾結合蛋白的鑒定等。此項工作由趙英明課題組和賓夕法尼亞大學Benjamin Garcia教授課題組共同完成，黃河博士是文章的第一作者，趙英明教授是通訊作者。

6.Anal Chem：董夢秋等開發出定量蛋白質組學數據解析軟體pQuant
doi:10.1021/ac404246w

中科院計算所pFind研究團隊與我所董夢秋實驗室合作開發了定量蛋白質組學數據解析軟體pQuant，用計算方法排除干擾信號的影響、提高肽段和蛋白質的定量準確度並對每個定量值進行準確性評價。

基於質譜的定量蛋白質組學是現代生物學技術的生長點之一，用於測量複雜生物體系中蛋白質及其翻譯后修飾在不同條件下的丰度變化，是研究蛋白質功能和藥物作用機制的重要工具。已有的定量軟體往往不能有效排除干擾信號，定量值的計算方法有待完善，而且缺乏準確性評價，致使輸出結果「魚龍混雜」，引起的假陽和假陰兩方面的困擾都比較嚴重。為了更好地解決這些問題，pQuant開發者—計算所的劉超同學—研究了幾百個可疑定量值的原始質譜圖和色譜圖數據，找原因、攢經驗，充分挖掘肽段的質譜、色譜信號特點以及從肽段定量到蛋白質定量的方法，靈活應用各種組合和統計演算法，建立了一整套非常細緻的數據分析流程。為了驗證pQuant的性能，董夢秋實驗室的宋春青同學通過輕重SILAC或14N／15N標記哺乳動物細胞或細菌，從10：1到1：10按不同比例混合得到14套標準樣品，產生了14套測試數據集。測試結果表明，pQuant定量結果的準確性明顯超過定量蛋白質組學領域的兩個主流軟體Census和MaxQuant，主要表現在：（1）pQuant輸出的非數比值數目（即不能定量的部分）佔總比值數目的0.01–0.5%，遠低於Census的MaxQuant的對應比例2.5–10.7%和1.8–2.7%；（2）Census和MaxQuant輸出了許多不準確結果，其定量值的標準差是pQuant的1.3–2倍；（3）pQuant給出了肽段和蛋白質定量比值的置信區間，而Census和MaxQuant沒有準確性評價。

上述結果以「pQuant Improves Quantitation by Keeping out Interfering Signals and Evaluating the Accuracy of Calculated Ratios」為題，於2014年6月3日在美國化學會主辦的《Analytical Chemistry》期刊上發表。

7.Nature：科學家發布人類蛋白質組草圖裡程碑成果
doi:10.1038/nature13319; doi:10.1038/nature13302

日前，兩個國際小組均在《自然》雜誌上公布了人類蛋白質組第一張草圖，這些在大部分非患病人體組織和器官中表達的精選蛋白，為更好的理解疾病狀態下發生的機體變化，奠定了堅實的基礎。這兩項最新研究揭示了人類基因組的更多複雜性，並從之前認為屬於非編碼區域的基因組中發現了新蛋白。

在第一篇文章中，來自約翰霍普金斯大學的蛋白質組研究員Akhilesh Pandey，與來自印度生物信息學研究所等處的研究人員合作，分析了30種不同的組織類型，編撰了由84％所有預期編碼蛋白的人體基因翻譯得到的蛋白。

這項研究識別出17， 294個蛋白編碼基因，並通過表達分析證明了組織和細胞特異性蛋白的存在，並且研究人員還通過從註解的假基因、非編碼RNA和未翻譯的區域識別翻譯的蛋白，表明了「蛋白基因組」分析的重要性。

同時另外一篇文章中，來自德國研究人員慕尼黑工業大學的Bernhard Küster等人創新性的推出了一個搜索性公共資料庫：ProteomicsDB，這一資料庫公布了18，097個基因獲得的蛋白，占目前預計人類蛋白總數（19， 629）的92％。這種數據能用於識別數百個翻譯的lincRNAs，對藥物敏感的標記，以及用於發現mRNA和組織中的蛋白水平之間的定量關係等。

這兩個研究組都利用了質譜方法分析人類組織，Pandey研究組分析的是全新的數據，針對了多種不同健康人體組織的數據，其中包括七種胎兒組織和六種血細胞類型。

而Küster研究組則採用了稍微有些不同的方法，他們彙集了已有質譜分析數據，以及同事的一些成功，這些大約佔據ProteomicsDB數據的60％。為了填補這些數據間的空白區域，Küster實驗室構建了自己的質譜數據，分析了60個人類組織體液，13個體液，以及147個的癌細胞系。Küster表示，他們只挑選了高解析度的公共數據，這些數據具有嚴格的計算過程，高質量控制標準。

8.Cell：iPS形成具體步驟與蛋白質組變化
doi:10.1016/j.cell.2012.08.023; doi:10.1016/j.celrep.2012.10.014

iPSC具有和胚胎幹細胞（ESC）類似的特徵和功能，卻極大程度避免了ESC研究和應用中面臨的倫理和排斥等諸多障礙，因此這一新技術給基於幹細胞的個性化治療和再生醫學帶來了光明的前景。諾貝爾獎得主Yamanaka教授及後來的大量研究都表明Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc（OSKM）等轉錄因子對iPSC的形成具有至關重要的作用，但是對於上述轉錄因子激發iPSC形成的步驟和機制尚不明確。

為了揭開這個謎底，來自哈佛-麻省總醫院的兩位知名科學家：Sridhar Ramaswamy和Konrad Hochedlinger進行了iPS細胞形成的轉錄分析，發現了一種雙相過程。其中c-Myc/Klf4驅動了第一波，Oct4/Sox2/Klf4驅動了第二波，這種雙相過程導致了一些細胞難以重編程，如果能提高4個因子的表達，就可以解決這一問題。

在另外一篇文章中，研究人員採用了一種稱為深度定量蛋白質組學（in-depth quantitative proteomics）的方法，分析成纖維細胞重編程為iPS細胞過程中蛋白質組的變化，從蛋白種類和數量上的變化來闡述重編程過程。

研究人員收集了6個時間段的樣品進行分析：蛋白收集，在多肽上加上穩定的同位素標記，然後利用高通量納米液相色譜-串聯質譜進行分析，由此發現重編程的第一天和倒數第三天出現了蛋白質組的一個兩步複位過程，這些蛋白以一個高度協調的方式發生著變化，出現了幾種生物學進程，比如電子傳遞鏈複合物的電化學變化，中間階段囊泡的運輸，還有最後階段中的EMT樣進程等。

這項研究以定量蛋白質組學為基礎，進行了大規模（8000種蛋白），大範圍（7個數量級）的分析，明確的指出了重編程過程是一種多步驟進程，目前大部分研究集中在起始階段，而這項研究發現了前三天和后十二天的變化，解析了其中微妙的中間階段，將進一步增強我們對細胞重編程機理的認識。

9.Dibetes：尿蛋白質組學可用於早期診斷糖尿病腎病
doi:10.2337/db12-0348

糖尿病腎病（DN）是一種逐漸進展的腎臟疾病，由長期高血糖引起的糖尿病的重要併發症。在西方國家，糖尿病腎病是透析的最常見原因。早期發現糖尿病腎病或許能運用藥物進行干預治療，從而延遲或避免使用腎臟替代治療。為此，德國研究者Zürbig P進行了一項關於運用尿蛋白質組學診斷糖尿病腎病的研究（Urinary Proteomics for Early Diagnosis in Diabetic Nephropathy）。研究結論發表在Dibetes 2012年12月刊。Dibetes 影響因子為8.1。

該研究運用毛細血管耦合質譜儀(CE-MS)來分析尿中小分子量蛋白質組。共選用35例1型和2型糖尿病患者的尿標本進行研究，所有試驗對象的尿標本以前均使用慢性腎功能不全的生物標記分類器作為診斷糖尿病腎病的標準。

研究發現，與把尿白蛋白作為診斷糖尿病腎病的標準相比較(AUC 0.67)，使用毛細血管耦合質譜儀(CE-MS)能在大量蛋白尿出現前5年就可檢測出陽性結果(AUC 0.93)。統計分析后得出使用以前診斷慢性腎功能不全的生物標記分類器作為診斷糖尿病腎病的標準已經過時。白蛋白分泌增加之前，膠原蛋白片段已經開始減少。因此，膠原蛋白片段是發生大量蛋白尿3-5年前的主要標記物。

10.PLoS ONE：蛋白質組學研究的一種新的技術手段
doi:10.1371/journal.pone.0046530

島津全球應用技術開發中心趙寧偉研究團隊在蛋白質組學的研究上取得了新進展。他們描述了一種新的融合免疫沉澱，蛋白電泳，納升液相和液質離子阱飛行時間質譜用於分析小鼠燒傷模型血清中β-Catenin protein complex的研究策略。結果發現了有顯著差異表達的3種伴侶蛋白。實驗證明免疫沉澱配合電泳一次分離和納升液相二次分離的的檢測方法可推廣至更廣泛的in vivo protein complex研究，且這種方法不僅有效地提高了蛋白質識別的靈敏度，也極大地增加了蛋白質序列覆蓋率和Mascot的統計學得分，從而最大限度地降低了質譜應用在蛋白質組學研究上長期以來的詬病，即蛋白質識別的假陽性。

該項工作由趙寧偉研究團隊，江蘇省中醫院藥理系，南京大學醫藥生物技術國家重點實驗室和溫州醫學院附屬第一醫院合作研究完成，已經被在線發表於國際生物醫學綜合類知名期刊 PLoS ONE ，此項成果作為蛋白質組學研究的一種新的技術手段，在生物標誌物的發現、細胞信號轉導等領域將有著廣闊的應用前景。

11.MCP：鑒定出小鼠胚胎成纖維細胞和人胚胎幹細胞的分泌蛋白質組
doi:10.1074/mcp.M112.020503

來自美國北卡羅來納州立大學的研究人員開發出一種新技術來鑒定細胞分泌的蛋白。這種新方法應當有助於研究人員在細胞生物學上收集精確的數據。

在這項新研究中，研究人員開發出的這種新方法是基於一個事實：每個細胞利用它的分泌途徑來包裹它的蛋白。每個細胞合成蛋白，然後通過這種途徑運輸它：將它包裹在袋狀的膜中，最終將它運輸到胞外。

在這種新技術中，研究人員採集細胞樣品，分離出分泌途徑中含有蛋白的細胞器。他們然後利用質譜分析這些細胞器中的物質以便觀察細胞正在分泌哪些蛋白。利用這種方法，他們能夠鑒定出小鼠胚胎成纖維細胞和人胚胎幹細胞分泌的蛋白。

12.MCP：開發出檢測細菌蛋白質分泌的蛋白質組學技術
doi:10.1074/mcp.M112.017533

近日，來自聖母大學艾克研究所的研究者開發出了一種新型方法可以直接檢測細菌分泌蛋白，這或許為治療包括肺結核在內的許多疾病提供了新的思路和方法。相關研究成果刊登在了國際雜誌Molecular and Cellular Proteomics上。

研究者Champions指出，細菌可以使用多種分泌系統來通過細胞膜轉運蛋白質，從而於外界環境進行相互作用。對於引發肺結核的致病菌結合分歧桿菌來講，這些系統可以轉運蛋白質來促進細菌於宿主細胞的反應，從而引發機體產生毒性表現。

研究者使用MALDI-TOF質譜儀，對細菌蛋白質組學進行了特異性修飾，使得科學家用激光電離蛋白質從而達到檢測細菌蛋白質的目的。這種新型方法可以用於特異性地監控蛋白質分泌的特殊形式，比如檢測結合分歧桿菌或者金黃色葡萄球菌主要的毒力決定蛋白質。

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