心臟基因治療研究最新進展

心力衰竭是世界性的公共健康重大問題.隨著人口的老齡化,其死亡率和住院率長期以來居高不下.據估計目前全球患病人數超過３８００萬;在,心血管病患者約２.９億,其中心力衰竭患者４５０萬.長期以來,臨床藥物(β受體阻滯劑、血管緊張素轉化酶抑製劑、血管緊張素受體拮抗劑、醛固酮抑製劑、利尿劑、竇房結離子通道抑製劑)和置入性器械治療(心臟再同步化治療、左心室輔助裝置)為防治心力衰竭做出了巨大貢獻,並且提高了患者的長期生存率.然而隨著疾病的進展,心力衰竭患者仍然會進入疾病的終末期.因此新的心力衰竭治療手段顯得尤為重要.

近年來,隨著分子生物學研究的快速進展,對心力衰竭相關信號通路分子的逐步深入認識,一些針對於心力衰竭治療的新的分子靶點被鑒定出來;然而這些信號通路分子很難通過藥理的方法來調控,因此運用基因的手段另闢蹊徑,可以直接且特異地在分子和細胞水平上調控心力衰竭的病理過程.一些靶基因的研究已經從基礎研究進入了臨床試驗階段,並且已經取得了一定的治療效果,展示出了革命性和突破性的治療前景,但同時也存在著喜憂參半的現狀.

心力衰竭的基因治療定義

心力衰竭的基因治療是通過化學、物理或生物等各種技術,將目的基因用載體包裝后通過各種方法導入受體的心肌細胞或心肌組織中,通過過表達糾正或干擾表達在心力衰竭病理過程中異常表達的靶基因,從而起到治療或減輕心力衰竭癥狀的治療方法.

靶基因的選擇

在心力衰竭中受影響的基因可分為三類.第一類為編碼已確認的可影響心力衰竭進程蛋白質的基因,比如,編碼鈣處理蛋白、β腎上腺素能受體系統、腎素Ｇ血管緊張素系統的基因,此類基因因為與心力衰竭的作用明確,最有可能作為進行基因治療的候選基因;第二類基因的表達與心力衰竭有關,但沒有明確證據表明其起到影響心力衰竭的作用,如編碼氨基末端腦鈉肽原(NT-proBNP)的NPPB,其可作為心力衰竭的生物標記物,而不作為基因治療的候選基因;第三類基因為通過基因晶元發現的數以千計的在心力衰竭中出現變化的基因,此類基因由於其與心力衰竭的關係有待闡明,尚不適合作為用於基因治療的候選基因.心力衰竭的病理過程中,興奮收縮偶聯的異常存在於在心力衰竭發展過程中的各個節段.因此,針對於此的各種不同的離子通道蛋白、轉運蛋白和關鍵蛋白的靶基因治療均可能使心臟的收縮功能恢復.其他的靶基因包括增加血管新生、增加幹細胞的歸巢及具有細胞保護作用的靶基因.下面介紹幾種常用的治療心力衰竭的靶基因.

(一)增加心肌收縮力的靶基因

β腎上腺能系統的靶基因:β腎上腺素能系統是心肌收縮的關鍵調節系統之一.兒茶酚胺與β腎上腺素能受體(β-AR)結合,激活G蛋白和腺苷酸環化酶(AC),從而增高心肌細胞內環磷腺苷(cAMP)的濃度,繼而活化蛋白激酶A(PKA)、增加心率和增強心肌收縮性,誘導心肌蛋白合成,從而導致心肌肥大.心力衰竭時β-AR明顯下調,並且敏感性降低,這是因為交感神經長期興奮抑制了β-AR的合成,受體與AC脫偶聯和下游cAMP介導的傳導途徑修飾(如Gi增高導致Gs/Gi比值下降).G 蛋白偶聯受體激酶-２(GRK２)是β-AR 的脫敏劑,因此通過增加β-AR 或βARKct(GRK２的抑製劑)或AC的表達,均可以顯著增加轉基因動物心肌收縮性和左心室功能.Jones等發現心臟手術時將編碼人β-AR基因的腺病毒轉染至豬心肌細胞,有助於改善左心室收縮功能.但持續刺激β-AR系統會引起心肌毒性和心律失常,加速心力衰竭.已有實驗顯示,過表達β２-AR的轉基因小鼠行主動脈縮窄術后,左心室心功能不全程度高於野生型小鼠.進一步研究發現過表達βARKct較過表達βＧAR能更有效地改善運動耐量、心功能、心室重構及心力衰竭相關性全身炎性反應等,提示減少對β-AR的脫敏比單純增加β-AR的數量更有效.在心肌梗死後的實驗豬心力衰竭模型中發現,AAV６.

無論何種病因引起的心力衰竭,其共同病理特徵均有鈣穩態失調和心肌收縮舒張功能障礙.正常情況下,細胞內鈣穩態通過細胞膜和肌漿網兩個鈣離子循環來維持,胞膜存在三種鈣轉運系統:電壓依賴式鈣通道(L型為主)、鈉Ｇ鈣交換體(NCX)及鈣泵(PMCA);肌漿網通過肌漿網鈣釋放通道(主要為蘭尼鹼受體RyR２)、肌漿網鈣泵(SERCA２a)及肌漿網腔內鈣結合蛋白進行鈣轉運.上述鈣離子蛋白在心臟的收縮功能中起到了核心作用,一旦這些鈣離子蛋白有所異常,就很可能導致心肌漿網功能失調,進而導致心力衰竭.因此,目前一些心力衰竭基因治療主要針對鈣離子調控蛋白進行了大量的基礎和臨床實驗.

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２.小分子泛素樣修飾體-１(SUMO-１)SUMO-１是類泛素蛋白家族的重要成員之一,通過名為SUMO 化的轉錄后修飾與SERCA２a發生相互作用,以增強SERCA２a的穩定性和活性.SUMO-１被證實在實驗動物和臨床患者的衰竭心臟中均明顯降低,在小鼠中敲除SUMO-１則直接出現心力衰竭.在衰竭心臟中SERCA２a的的SUMO 化也隨之降低.有研究使用經AAV９病毒載體轉入SUMO-１,可以逆轉主動脈縮窄小鼠的心肌肥厚和心功能不全.在心肌梗死的實驗豬上也發現AAV１/SUMO-１改善心肌梗死心臟的心功能,逆轉左心室重構.

３.受磷蛋白(PLN)

４.蛋白磷酸酶１(PP１)和蛋白磷酸酶１抑制因子-１(I-１)PP１去磷酸化PLN,增加PLN 對SERCA２a的抑制作用.I-１抑制PP１,因此PP１間接抑制SERCA２a,I-１則增強SERCA２a活性.心力衰竭患者心臟PP１活性增加,I-１表達降低.在主動脈縮窄小鼠,心臟持續性活化的(constitutively active)I-１過表達通過間接增加PLN 的磷酸化改善心功能.近年來,在心肌梗死的實驗豬上進行的幾個獨立研究發現,AAV２,AAV８、AAV９作為載體表達I-１后,心功能明顯改善.

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(三)肌絲蛋白的靶基因

心肌細胞的收縮是肌動蛋白和肌凝蛋白相互作用的結果,其沿著肌絲蛋白移動的能量來源於ATP的水解.在動物實驗中的研究發現,用２-deoxyATP代替ATP,能夠明顯通過增加肌凝蛋白與肌動蛋白的結合和循環運動能量,但是２-deoxyATP得生成有限,過表達R１R２酶能夠顯著增加２-deoxyATP的含量,從而導致心肌細胞收縮能力的增加,這已經在離體的心肌細胞中得到證實,同時在R１R２過表達的轉基因小鼠中,左心室的收縮功能也明顯增強.

(四)促進血管新生的靶基因

在缺血性心臟病中進行的大量基礎和臨床研究均證實血管內皮生長因子(VEGF)能夠促進血管新生,然而臨床試驗的療效卻缺乏一致性,難以滿意重複出基礎研究中令人鼓舞的結果.其原因可能是過表達VEGF-A 后不能形成有效的血管腔(無血流).在小鼠的心梗模型中,用修飾后的RNA(modRNA)來瞬時高表達VEGF-A可以增加有效血管腔的生成,同時降低心肌梗死小鼠的死亡率.

(五)具有心肌保護作用的靶基因

心力衰竭是心功能漸進性惡化的病理生理過程,其與多種病理應激反應相關,如氧化應激、凋亡及缺血/再灌注損傷有關.近期研究發現血紅素氧化酶-１的過表達對於缺血再灌注損傷具有保護作用,並且已經在動物實驗中證實.

(六)促進幹細胞歸巢的靶基因

SDF-１/CXCR目前已經被證實能夠促進幹細胞向心肌梗死後心肌細胞歸巢.SDF-１是一種趨化蛋白因子,能夠與G蛋白偶聯受體CXCR４相結合.SDF-１最開始被認為能夠招募骨髓來源的幹細胞歸巢到受損的心肌組織,因此被認為是內源性組織修復的重要調節因子.臨床前期實驗已經證實了SDF-１在心肌梗死邊緣區的過表達能夠改善心功能並且增加周圍組織心臟血管的密度.

(七)miRNA靶基因

miRNA是２１-２３個鹼基長度的非編碼小RNA,在心血管病的病理進程中起了重要作用.通過腺相關病毒轉入RNA以提升起到治療作用的miRNA 水平或轉入短髮夾RNA 和小干擾RNA 造成基因沉默,降低引起不良效應的miRNA水平,目前在基礎研究中已經得到實現.通過AAV９轉入miR-１會明顯減輕主動脈縮窄大鼠的心肌肥厚和心功能不全.通過AAV９轉入miR-３７８也會明顯減輕主動脈縮窄小鼠的心肌肥厚和心功能不全.在心肌梗死小鼠和主動脈縮窄小鼠,miR-３４上調,注射miR-３４的抑製劑(AntimiR-３４)則明顯改善心功能.在主動脈縮窄后的小鼠和臨床心力衰竭患者,miR-２５上調.上調的miR-２５通過抑制SERCA２a的作用,促進心功能不全的發生.通過AAV９使得miR-２５過表達明顯降低心臟收縮功能,通過注射miR-２５的抑製劑(AntimiR-２５)則明顯延緩心力衰竭進展.以miR-NA為基礎的基因治療效果目前還沒有來自大型實驗動物的報道,未來也還有待臨床試驗進一步驗證其療效.

載體的選擇

靶基因起作用需要通過各種載體的運輸到達目的細胞後起作用,因此載體有效性的選擇對於基因治療的有效性作用也是不可忽略的一道屏障.目前,雖然有少數研究嘗試使用裸病毒,但這種情況下,帶負電荷的DNA鏈難以穿透同樣帶負電荷的細胞膜,並且裸DNA極易被各種酶降解,導致難以持久穩定表達,效率低下.因此,絕大多數基因治療的研究均使用載體傳遞目的基因.廣義上下面介紹幾種常用的病毒載體和非病毒載體.

(一)非病毒載體

在非病毒載體中,主要應用的是裸質粒DNA和脂質體.裸質粒DNA可以直接注射至治療區,其優點是可以相對容易的大量製備,沒有DNA片段長度的限制,引起細胞及宿主的免疫反應相對較輕,但是其進入細胞并行使功能的效率偏低,大多持續３~４周,具有一定的免疫原性.脂質體是一種帶有電荷的脂質顆粒包裹的DNA,能夠與細胞的磷脂表面融合,進入細胞,轉染效率比裸DNA高,並能攜帶較大的DNA 分子,缺點是脂質體的不斷積累能夠引起毒性,目前主要在腫瘤和囊性纖維病的治療中應用.總的來說,非病毒載體雖然更加安全,但轉染效率很低,靶向差,大多僅用於局部給葯.

目前,出現了一種新的非病毒載體的方法用於基因治療,這種方法是基於使用核酸修飾過的mRNA(被稱為mo-dRNAs).modRNAs與傳統的未修飾核酸一樣,不能與Toll樣受體結合,在轉染過程中不引起機體的固有免疫反應,因此可以在體外反覆注射.此外,mRNA 只需要直接在胞質內翻譯即可,不需要整合至宿主的核酸中.因此modR-NAs能夠引起短時的高效率的靶基因過表達,一般持續時間為２~６d.Turbell等研究發現用納米微粒載體包裝后的modRNAs,在直接心肌注射后在２０min后即可在大鼠和豬的心臟中檢測到有靶基因的表達.

(二)病毒載體

病毒載體主要包括反轉錄病毒、慢病毒、皰疹病毒、痘病毒、腺病毒、腺相關病毒等.相對於非病毒載體,病毒載體的轉染效率明顯高得多,但是存在免疫反應問題.

各種病毒載體都有自己的局限性,目前為止,絕大多數的心血管疾病的基因治療實驗都是使用腺病毒載體進行.腺病毒可以對絕大多數的細胞類型進行感染,其中包括心肌細胞,轉染后能夠得到較高的靶基因的表達,但是其表達是一過性的(一般持續１~４周);腺病毒載體最主要的缺點是能夠引起較強烈的固有免疫反應,因此限制了其在基因治療中的廣泛應用.

慢病毒載體是基因治療的另一種載體,其引起的免疫反應較為溫和,與其他病毒載體相比較,其優點是能夠轉染終末分化細胞(包括心肌細胞),慢病毒轉染后的靶基因表達是穩定持續的表達,其特點是能夠將包裝好的靶基因整合入宿主的基因組中.但是其缺點是其對心血管系統的細胞(特別是心肌細胞)缺乏特異性的趨向性,需要通過心肌組織內注射的方法來實現心肌細胞的轉染.基於安全性的考慮,慢病毒載體目前還未能在心力衰竭的基因治療的臨床實驗中使用.

另外一種具有應用前景的病毒載體是腺相關病毒(AAVs),腺相關病毒(AAV)是一種細小病毒,僅含有單鏈的病毒DNA,轉染效率較腺病毒更高.自從Ran等從金黃色葡萄球菌中篩選出分子量約為3.2kb的相對較小的SaCas９(Staphylococcus aureus Cas９)后,使得靶基因包裝入AAV載體變為可能,從而可以進一步實現在體細胞編輯.經過重組后,能夠僅含有治療基因,因此致瘤性很低,是一種很有前景的選擇.重組后的腺相關病毒(AAVs)能夠轉染有絲分裂細胞及終末分化細胞,rAAVs不需要與宿主的基因組整合,並且能夠穩定持續的表達.並且運用腺相關病毒作為載體來進行基因治療的優點是有些亞型的腺相關病毒對於心肌細胞具有趨向性,因此,腺相關病毒在心力衰竭的基因治療中,是非常理想的基因轉移系統.現有的Ⅱ期臨床試驗,均使用腺相關病毒.腺相關病毒有１３個血清型,其中AAV１、AAV６、AAV８和AAV９對骨骼肌和心肌的趨向性最高.在CUPID的臨床實驗中,在＞３００個的患者中均未能檢測到細胞免疫反應,但是值得注意的是,一些患者中(８０％的病例來源於東歐)機體中本來存在的針對於該種病毒載體的中和抗體的滴度卻明顯升高,限制了腺相關病毒在所有人群中的廣泛使用.儘管存在這些問題,rAAVs病毒載體依然是心力衰竭靶基因治療中最具有前景的病毒載體.

(三)心肌特異性啟動子

近些年來,心肌特異性的啟動子如MHC啟動子,MLC啟動子及肌鈣蛋白T 的啟動子使靶基因的表達限制在心臟,同時疾病特異性的啟動子例如ANF(心力衰竭時大量表達)啟動子在動物實驗中已經開始運用,雖然這些能夠使靶基因特異性的在心臟組織表達,但是其表達的強度明顯弱於常規持續性表達的啟動子,並且需要高濃度的病毒載體.可誘導的啟動子已經在動物實驗中使用,該種啟動子可以被藥物或者小分子蛋白激活或者沉默.

基因傳遞方法的選擇

選定目的基因和載體后,還需要有合適的基因傳遞方法,以確保基因治療主要針對衰竭心臟,轉染進足夠多的心肌細胞或心臟其他細胞,獲得足夠長的療效.關於基因傳遞方法,主要有血管腔內轉移和直接注射兩種方式.

(一)血管腔內轉移

１.冠狀動脈內導管基因傳遞是目前最常用的方法,也是最有臨床推廣價值的心臟基因轉導技術.已有諸多實驗證實,利用此技術轉移目的基因的有效性及安全性.以常規冠狀動脈內導管方法進行基因轉導注射時,可以發現所轉入基因主要在左心室表達,右心室沒有表達或者表達水平很低.而對於以右側心力衰竭為主要表現的動物模型,可通過冠狀動脈右主幹注射目的基因以獲得滿意的表達水平.其轉移效率受到動物類型、導管及載體的生物相容性、晶體溶液的使用、高冠狀動脈流率、暴露時間、病毒濃度和溫度的影響.單純冠狀動脈輸注可能無效,需結合其他輔助措施來提高轉導效率,如提高血管床通透性、增加灌注壓及提高細胞與心室充分接觸的時間等.目前已有一些研究通過阻斷管狀靜脈竇增載入體在血管內停留時間、逆行灌注及建立再循環的閉環系統,從而達到提高轉移效率的目的.近來有研究試圖應用基因洗脫支架來達到基因傳遞的目的.

２.靜脈逆灌注在噬齒類動物實驗中,高濃度的病毒載體可通過靜脈逆灌注進行有效轉導.但是由於人體較大的血容量,將導致到達心肌的病毒載體有效濃度得到稀釋,而過高濃度的病毒載體又將引發轉導的安全性問題.一些使用大型動物的實驗證實,應用心肌趨向性腺病毒相關性載體可有效轉導目標基因.

(二)直接注射

１.直接心肌注射直接心肌注射是目前研究較為充分的一種基因轉導方式,但此方法只能在注射的局部及其周圍獲得較為令人滿意的表達,而且除非利用極細的針頭,這種基因轉導方法均會造成心肌組織不同程度的損傷.

２.心包腔內注射其原理為心包及心肌層解剖結構相比鄰及心包腔內注射相對較易實現病毒載體的傳遞.經過心包腔內注射,所轉入基因可分佈到約４０％的心肌表面,尤其在左心室前壁及室間隔可以獲得滿意表達,但心內膜下轉染少,如同時輸注膠原酶和透明質酸酶,有助於通過心包層細胞內及細胞間質的屏障,增加心內膜下轉染.

３.心室內注射通過心室內注射技術可以在動物模型上獲得最活躍的目的基因表達,這些研究均通過鉗夾主動脈和(或)肺動脈以獲得儘可能長的轉染時間.主動脈和肺動脈交叉鉗夾技術,可減少回心血量,左心室舒張末壓基本不升,使靜脈灌注在較低血流壓力下進行,病毒能有效進入心內膜,並且目標基因較少在肝、肺等其他非靶臟器表達,但此方法不利於心肌保護.

臨床試驗進展

目前心力衰竭基因治療的臨床試驗主要針對SERCA２a、SDF-１和AC６展開.在過去的一年,關於SERCA２a、SDF-１和AC６的Ⅱ期臨床試驗結果相繼公布,雖然在部分指標出現良性變化,但總體結果令人失望,這三項研究均未能延續基因治療在Ⅰ期試驗和臨床前試驗中的良好勢頭,但亦未發現明顯安全性問題.

(一)SERCA２a靶基因治療的臨床試驗

迄今為止,使用AAV１.SERCA２a的臨床試驗有３個:第一個是CUPID系列臨床試驗.CUPID的Ⅰ期試驗是第一個在人體上開展的心力衰竭基因治療.第二個臨床試驗是AGENTＧHF(NCT０１９６６８８７)臨床試驗,使用的靶基因及載體是AAV１-CMV-SERCA２a.該試驗為單中心、隨機、雙盲安慰劑對照實驗;第三個臨床試驗是SERCAＧLVAD(NCT００５３４７０３)臨床試驗,該試驗是在接受了左心室輔助裝置的心力衰竭患者中運用AAV-１-SERCA２a的基因治療心力衰竭,該試驗為評估基因治療后左心室輔助裝置的心力衰竭患者是否能夠在遠期使患者脫離左心室輔助裝置.CUPID系列臨床試驗研究是針對晚期心力衰竭患者進行AAV１.SERCA２a(商用名MYDICAR)基因治療的系列臨床試驗.從２００９年報道了Ⅰ期臨床試驗結果以來,至２０１６年已完成Ⅱ期.２００９年公布的一項針對晚期心力衰竭患者所做的Ⅰ/Ⅱ期CUPID研究觀察了AAV１包裝的人SERCA２a治療晚期心力衰竭的效果.該研究納入了９例慢性心衰患者,心功能NYHA分級Ⅲ/Ⅳ級,LVEF ≤３０％,受試者隨機分配至３個AAV１.SERCA２a中的一個劑量組,持續觀察１２個月,在治療６個月後進行了初步分析,５名患者癥狀得到改善,４名患者機體功能得到改善,２名患者生物標記物指標(NT-proBNP)得到改善,６名患者左心室功能或左心室重構獲得改善,１名患者病情出現惡化.另外２名患者因體內已經存在病毒載體的抗體,因而病情未出現好轉.更為重要的是,MYDICAR在試驗中表現出較好的安全性.

２０１１年完成的CUPID Ⅱ期是雙盲、隨機、安慰劑對照的臨床研究,其範圍擴大至３９例晚期心力衰竭患者,受試者隨機分配至３個AAV１.SERCA２a中的一個劑量組或安慰劑對照組,經單次冠脈內注射進行干預.大劑量治療組在治療６個月和１２個月後,癥狀好轉,運動能力提高,NT-proBNP水平降低,左心室主張末期容積下降.此外,所有AAV１.SERCA２a干預患者在治療后６個月和１２個月均出現運動能力改善,心血管事件發生率降低,慢性心力衰竭相關的住院率下降.

２０１４年報道的CUPID Ⅱ期臨床研究是２０１１年該研究的延續,針對的是單次AAV１.SERCA２a治療后隨訪３年的情況.該研究發現,各基因治療組在死亡率、心力衰竭加重情況、心力衰竭相關的住院率、心臟移植和左心室輔助裝置的需求均有不同程度的下降,其中在大劑量治療組最為明顯,後者的心血管事件複發風險較安慰劑對照組下降了８２％.大劑量治療組所有患者所轉染入的SERCA２a基因在患者體內仍存在.AAV１.SERCA２a治療所有治療組均顯示了較好的安全性.

２０１６年公布的CUPID Ⅱb期是雙盲、隨機、安慰劑對照、多國、多中心的研究,從１０個國家招募了２５０名中度到重度心力衰竭患者.每位患者至少隨訪１年,平均隨訪１７.５個月.該研究的一級終點是複發(因心力衰竭惡化需入院或門診治療),二級終點是初次終點事件(全因死亡、心臟移植或置入機械循環輔助裝置).基因治療組患者的一級和二級終點與對照組相比均未出現改善,無安全性問題報告.因而,CUPID Ⅱb期臨床試驗的結果是陰性的,未能證實能夠改善心力衰竭患者的預后.有鑒於此,AGENT-HF和SERCA-LVAD 這兩個原本緊接其後的臨床試驗被暫停,等待CUPID２期實驗的結果數據全面開放分析后,才可能繼續進行.以上試驗未達預期效果可能與載體選擇、給葯頻率、給葯途徑,甚至是種族、性別、年齡等因素相關.另外,SERCA２a臨床前探索都是在青壯年動物完成臨床前實驗,但臨床試驗多是招募病情較嚴重或年齡較大的患者,而此時鈣循環改善等局部變化可能不足以提升整體運動功能.受試者也可能因為其他生理結構老化或惡化太快,超過治療獲益程度,導致臨床效果不顯著.

(二)SDFＧ１靶基因的臨床試驗

針對於SDF-１靶基因的臨床試驗有兩個:STOP-HF及RETRO-HF臨床試驗.STOP-HF Ⅱ期臨床試驗為隨機、雙盲、安慰劑對照研究,評估SDF-１基因治療在LVEF＜４０％的缺血性心力衰竭患者中的安全性和有效性.SDF-１質粒經過１５次的心內膜心肌注射.SDF-１質粒使用了兩種不同的濃度(１５mg和３０mg),一級終點是治療４個月後患者的６min運動耐量和明尼蘇達生活質量調查表評分改變.結果顯示兩個治療組與安慰劑組間未見明顯差異.而在LVEF＜２６％的心力衰竭患者中,３０mg劑量的SDF-１質粒能夠將LVEF提高１１％,這種結果在治療一年後仍然存在,即使SDF-１基因在注入１個月後幾乎就不再表達.RETRO-HF研究是將SDF１質粒逆向灌注入心肌組織內,該研究目前還在進行中,其研究結果令人期待.如果RETRO-HF研究也顯示對LVEF較低的人群有效,將有力支持STOP-HF研究中SDF-１針對特定人群部分起效的結果.

(三)其他已進行的基因治療臨床試驗

AC６基因治療心力衰竭(AC６gene transferfor CHF NCT ００７８７０５９),其途徑是通過冠狀動脈內給葯的方式,在治療４周和１２周后評估其治療心力衰竭患者有效性和安全性.一級終點是治療４周和８周後患者運動耐量、心超LVEF值和左心室壓最大上升/下降速率(dp/dt).結果顯示給葯組與安慰劑組間的運動耐量未見明顯差異.但治療后４周LVEF在治療組比安慰劑組為高,而到了１２周兩組又無統計學差異.在治療后４周,左心室壓最大下降速率(－dp/dt)在給葯組好於安慰劑組,但左心室壓最大上升速率(＋dp/dt)無統計學差異.安全性方面,未發現AC６致心律失常的證據.總的來說,需要擴大樣本量來進一步證實AC６基因治療的有效性和安全性.

此外,鑒於AAV９-S１００A１在臨床前期大動物實驗中取得了良好的結果,在未來的幾年內,第一個S１００A１靶基因的治療人體臨床試驗即將開展.另一個正在計劃中的臨床試驗是使用rAAV２i８作為載體,該載體具有高度的心臟趨向性,靶基因是蛋白磷酸酶１抑制因子-１,該臨床試驗計劃使用四種不同劑量AAV包裝后靶基因來治療心力衰竭.

問題和展望

雖然心力衰竭的基因治療無論在動物實驗還是臨床試驗中都取得了可觀的成就,展示了具有革命性和突破性的成果,但也存在著諸多問題.

首先,由於細胞生理環境和生命周期非常複雜,對於基因治療來說,其效果並不能保持很長時間,導致患者也可能需要接受多個療程的治療.雖然有的研究通過加大治療劑量來達到使相關基因長期表達和細胞較長時間存活分化的效果,但加大劑量的長期安全性仍有待設計相關臨床試驗來闡明.

其次,人體的免疫系統功能強大,對外來的基因具有很強的排斥性,不但降低了治療效力,還給重複治療帶來了困難.病毒載體的選擇,也是治療中遇到的一大問題.如何尋找低毒、低免疫原性、高特異性的載體和幹細胞,是研究者們努力的一個方向.

再次,在實際治療中,許多疾病都是多基因致病,如高血壓、糖尿病等,目前的基因治療還遠不能有效地治療這類疾病.通過調控多個基因進行多基因聯合治療(如SERCA２a和SUMO１)最近已經在小鼠身上取得成效.近年來通過轉入數種轉錄因子,使得成纖維細胞轉變為心肌樣細胞也獲得了成功.這些成果也為將來進行多基因聯合干預的基因和細胞治療指出了新的發展方向.由於實驗動物和臨床患者之間的物種差異性、實驗條件和治療方法的差別,迄今為止,在動物實驗中取得的良好效果並不能滿意延續到臨床患者.甚至在動物實驗和臨床試驗上,都出現了不少困惑甚至是完全相反的結論.如在CUPID臨床試驗結果出現的與前期動物實驗不一致的結果,可能與AAVs病毒載體在不同物種間的感染率相關,同時,人群中的疾病背景也與前期動物實驗不盡相同,這些可能都會影響到基因治療中靶基因表達的有效性,同時,如何克服AAV病毒載體在一部分人群中引起的中和抗體的升高也是今後需要克服的一大障礙,這些基因治療中出現的問題都提示了基因治療需要更進一步精細調控的複雜性和必要性.

目前基因治療大部分仍停留在動物實驗階段,且取得了可喜的成果,用於臨床研究的基因治療仍處在起步階段,其有效性及安全性仍需進一步驗證,因而距離臨床常規應用也只是踏出了萬里長征的第一步.儘管如此,這些臨床試驗的成果必將為心血管病基因治療提供更多更新更有價值的參考.隨著高特異性載體的不斷出現,基因表達精準調控的不斷實現及３D列印、CRISPR/Cas９在體基因組編輯技術,以及外泌體(exosome)介導的基因傳遞和細胞間信號傳遞等新技術和新概念的不斷湧現,基因治療勢必在心力衰竭的治療方案中佔據一席之地.

本文摘編自葛均波、方唯一主編《現代心臟病學進展2017》之復旦大學附屬中山醫院上海市心血管病研究所、復旦大學生物醫學研究院黃家園、吳劍、鄒雲增著「心臟基因治療研究最新進展」。

現代心臟病學進展2017

葛均波 方唯一 主編

責任編輯：路 弘

北京：科學出版社 2017.06

ISBN 978-7-03-053009-7

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《現代心臟病學進展2017》由活躍在臨床一線的專家編寫，詳述了心血管病學，包括指南解讀、冠心病、起搏與電生理、結構性心臟病、高血壓、心力衰竭、血脂、心臟預防與康復等多個專題，全面地反映了心血管領域診、治、防的新進展和新理念，論述詳盡，科學性、實用性強。

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