液態活檢，哪些是我們不知道的？

在過去幾年中稱為「液態活檢」的新診斷概念已經有受到相當大的關注。 被腫瘤細胞釋放血液中循環腫瘤DNA（ctDNA）片段原則上與他們起源的腫瘤細胞含有相同的遺傳缺陷。因此，可以在血漿的細胞遊離DNA（cfDNA）中檢測到的分子改變，跨越腫瘤中鑒定的基因組改變的類型，包括點突變，重排，擴增，甚至基因拷貝變異。

圖1：實體腫瘤的液態活檢：該圖顯示了基於循環腫瘤DNA（ctDNA）和循環腫瘤細胞（CTC）的液態活檢的生物學基礎。還指出了液態活檢在臨床環境中的關鍵應用，包括腫瘤基因分型，評估藥物反應，跟蹤最小殘留疾病和監測克隆進化。

相關的分子信息也可以通過分析存在於細胞外囊泡中的RNA分子來獲得，例如外泌體或血小板。30多年前首次分離的外泌體是納米級囊泡大多數類型的細胞。漂浮在幾乎所有體液中的這些納米顆粒的核酸和蛋白質豐富的含量具有非侵入性分子診斷的潛力，並且可以代表新的治療遞送系統。此外，外泌體還可以影響腫瘤生物學，並且它們的整聯蛋白組成可通過確定器官特異性轉移龕來促進轉移。然而，目前的分離技術，如超速離心，不方便，不能實現高純度的分離。這代表了一個有趣的挑戰，可以用微流體技術解決，例如納米等離子體外泌體技術，其中感測是基於表面等離子體共振來實現無標記的外泌體檢測。特別地，來自腫瘤衍生的外泌體的蛋白質，RNA和DNA的富集和分析可能提供有關活腫瘤細胞的獨特信息。已經在實體瘤如胰腺癌或卵巢癌患者中進行了鼓勵證明臨床相關性的原理證據研究。

最近，提出腫瘤學血清血小板（TEPs）作為腫瘤相關生物信息的替代來源。 來自不同類型的局部和轉移性腫瘤和健康個體的患者的TEP的mRNA測序以96％的準確度檢測到腫瘤。TEPs潛在診斷作用的生物學與血小板和腫瘤細胞之間的相互作用有關，其改變RNA 血小板並影響腫瘤生長和傳播。關於TEPs的初步研究現在應該在更大的個體群體中得到驗證。 特別是影響接受治療和患病的癌症患者的mRNA含量的混雜因素需要評估。

在過去十年中，大規模的臨床研究集中在使用循環腫瘤細胞（CTC）計數作為預后和對治療反應的預測因子，特別是乳腺癌和前列腺癌。 雖然從血液中獲取CTCs比血漿樣品中的cfDNA分離更為麻煩，但CTC提供了獲取DNA，RNA和蛋白質水平信息的機會。 此外，原理證明研究表明在一小部分患者中體外功能和體內分析是可能的。

在本綜述中，我們專註於ctDNA和CTCs作為液態活檢的關鍵組成部分的臨床應用，並在這個快速發展的研究領域解決了開放性問題。

捕獲分子異質性和癌症ctDNA的進化

分子和細胞異質性是癌症的標誌，是腫瘤診斷和治療最大的挑戰之一。癌細胞的基因組不穩定性和表型可塑性導致病變特異性基因組表觀。 與單一組織活檢相反，血液攜帶衍生自位於不同轉移位點的癌細胞的DNA。雖然目前的證據表明，ctDNA和CTC可能代表整體疾病的分子代謝，但仍然正式地證明位於不同器官中的多個轉移性病變均勻分離了ctDNA和CTC。 屍體解剖組織和血液的分析可以進一步解決ctDNA如何闡明轉移癌的異質性。

正常和腫瘤細胞釋放DNA的機制是什麼？

癌症患者的正常循環cfDNA水平高於健康人。當腫瘤體積增加時，細胞周轉量也因凋亡和壞死細胞的數量也增加。 大多數cfDNA片段測量在180和200 bp之間，表明細胞凋亡可能在循環中產生大部分的cfDNA。 有趣的是，在至少一些腫瘤類型（例如肝細胞癌）以及數千個鹼基對的大的cfDNA片段中已經報道了較短的ctDNA片段，這可能是壞死的結果。 液體活檢正在迅速地納入癌症患者的臨床治療中，但是還有待澄清的是，cfDNA的確切性質和起源尚待澄清。 這一領域的進一步進展動物模型和耦合ctDNA分析與自噬研究。

哪種體液含有循環腫瘤DNA？

大多數研究集中在癌症患者的血液（血漿或血清）中釋放的cfDNA。值得注意的是，可以描述的體液類別最近已經遠遠超出血液，現在包括尿液，腦脊髓液（CSF）和唾液。例如，最近的研究已經表明，可以使用反式腎DNA來檢測與耐藥性相關的點突變，並且可以從CSF成功獲得腦腫瘤的精確分子譜。頭頸癌的分子情況可以從唾液中獲得。每天可以獲得尿液和唾液，從而提供縱向監測癌症患者的特徵的可能性。在某些情況下，腫瘤的生物學及其解剖位置決定哪種體液最適合於液體活檢。例如，雖然在大多數轉移性癌症患者的血液中可以發現ctDNA，但腦腫瘤患者（如神經膠質瘤和成神經管細胞瘤）循環中的cfDNA數量往往有限。相反，CSF（由脈絡叢分泌）可以成功應用於定位在腦中的腫瘤患者的ctDNA。

液態活檢的臨床應用早期檢測和實體腫瘤基因分型：在血液真相？

迫切需要早期癌症特別是在晚期發現的腫瘤類型（例如肺癌和胰腺癌）的可靠指標。兩種CTC和ctDNA均由早期腫瘤病變釋放，因此具有引起研究團體和公司發展血液癌症測試的期望。儘管最近發展了非常敏感的技術，但是為早期癌症檢測開發可靠的測試仍然具有挑戰性。 特別是申請用於廣泛群體篩選的血液檢查需要精確的特異性。 癌症相關的突變發生在年齡的增加，即使在一生中從未發展過癌症的個體，這可能導致假陽性結果。

癌症篩查研究通常與癌症患者與對照（健康個體或良性疾病患者）進行比較。專註於發生癌症風險高的患者（如慢性阻塞性肺疾病）[COPD]患者）是加快此驗證過程的有價值的策略。 Ilie等人（2014）報道，在無臨床可檢測的肺癌的COPD患者中檢測到CTC。該研究包括168例COPD患者和77例無COPD匹配吸煙習慣的受試者。168例患者中有5例檢出CTC，對照組未檢出CTC。通過計算機斷層掃描（CT）掃描篩查檢測CTC陽性COPD患者的年度監測肺結節1-4年後CTC檢測，導致晚期肺癌的手術切除和組織病理學診斷。這些初步結果需要在較大的隊列中進行驗證，並且可能導致非特異性的事件需要排除非癌症患者的發現，例如將非惡性上皮細胞釋放到患者血液中。

通過監測ctDNA檢測癌症也是積極調查的一個領域。然而，具有不同量的cfDNA的血液樣本中非常少量的ctDNA的鑒定仍然存在挑戰。 cfDNA組成主要來自正常細胞的DNA和源於腫瘤細胞的相對較小的部分。標準DNA分析方法（如Sanger測序）的靈敏度不允許檢測ctDNA。除了敏感性，基於ctDNA的測試的特異性也是具有挑戰性的。癌症相關的司機突變發生在年齡的增加，即使在一生中從未發展過癌症的個體。例如，在超過10％的非癌症對照中已經檢測到TP53基因的突變，並且在10％的年齡較大的個體中觀察到具有體細胞突變的克隆造血超過65歲，是後來血液癌症的強大危險因素。然而，從克隆造血轉為血液癌的絕對風險是適度的（每年1.0％）。最近，Kato等人概述了良性病症中基因「驅動因素」的難題，如痣中的BRAF突變或脂溢性角化病的FGFR3突變。因此，檢測cfDNA上的癌症相關突變可能並不表明所測試的個體在其一生中已經有癌症或將會發展成癌症。液體活檢方法的興趣顯著增加，目前已有大量化驗。歐洲聯盟CANCER-ID（www.cancer-id.eu）涵蓋37個機構，為國際化驗驗證提供了新的平台。

液態活檢可檢測和監測早期患者的最小殘留疾病？

對血液惡性腫瘤患者的管理有效地採用了可靠的檢測和定量的最小殘留病變（MRD），但不能在實體瘤患者中進行。 早期檢測微小轉移灶目前無法通過臨床成像程序（CT或MRI掃描）檢測到，這將大大增加癌症的複發和轉移性疾病的機會。 雖然ctDNA和CTCs在轉移性患者中的疾病監測的臨床相關性已經確立，但這些生物標誌物在早期患者中的作用尚待確定。 MRD可能是液態活檢的一個關鍵領域，在一個1,493名非轉移性乳腺癌患者的大型研究中，Rack等 表明，化療后持續的CTCs的存在顯示出對無進展和總體生存的負面影響。

在非轉移性癌症患者中，可以優化基於ctDNA的液態活檢，可能在臨床或放射學複發之前，以捕獲和監測治癒性切除后MRD的基因組標誌物，。類似地，ctDNA分析可用於分層患者誰是高風險的複發和避免低危患者不必要的全身治療的毒性。例如，最近的研究表明，非轉移性乳腺癌和結腸直腸癌患者血漿中腫瘤基因組改變的鑒定預計臨床轉移性複發的診斷，還發現手術后ctDNA的增加與除腦外的遠處的轉移灶的發生相關。總之，基於CTC和ctDNA的篩查具有較高複發風險的患者可能在臨床轉移發展前為治療干預創造機會。 將MRD的高風險患者分層監測到更強烈的治療是另一個重要的應用。例如，在手術切除原發性腫瘤后，Dukes B型結腸癌患者不接受輔助化療。 然而，這些患者中的很大一部分（10％-20％）將在手術后5年內複發，並且通過RT-PCR分析外周血中plastin-3 RNA的CTC檢測有助於預先確定這些高危患者。

我們可以使用液態活檢來指導治療嗎？

目前對轉移性疾病患者進行靶向治療的決策是基於原發性腫瘤的分析。此外，已知藥物治療（化學或靶向）影響癌症的分子格局。重要的是，原發性腫瘤切除后多年可能發生轉移性複發，從切除的原發性腫瘤獲得的信息可能過時。 雖然轉移性病變的再分期已經開始變得更加可接受，但是轉移性病變的活組織檢查是侵入性手術。相反，液體活檢可以在治療過程中重複分析，可以對治療反應或實時抗藥性的出現進行指導。 在本節中，我們重點介紹ctDNA和CTC的分子分析如何有助於更好地了解治療抵抗力和改善個性化抗癌治療的問題。

乳腺癌： 雌激素受體（ER）陽性乳腺腫瘤患者接受內分泌治療，但可以攜帶ER陰性CTC。 這可能是潛在的抵抗機制，目前正在臨床試驗中進行評估。 ER基因的突變在20％的轉移性乳腺癌患者的活組織檢查中發現。 可以在ctDNA中容易地鑒定ER基因中的體細胞突變。 在乳腺癌患者的ctDNA中可以檢測ER突變與抗內分泌治療。 這些數據進一步表明，血液可用於鑒定單次轉移性病變的測序未發現的其他ER突變。

編碼磷脂醯肌醇3-激酶（PI3K）的PI110a催化結構域的基因PIK3CA是乳腺癌中最常見的突變致癌基因，超過80％的體細胞PIK3CA突變發生在三個反覆熱點位置之一。 針對PIK3CA的幾種藥物臨床使用。 用於檢測轉移性乳腺癌患者PIK3CA突變的血漿衍生ctDNA的分析是可行的。 值得注意的是，PIK3CA突變狀態可以改變疾病複發。也可以在轉移性乳腺癌患者的富集CTC庫中檢測到PIK3CA突變。分離單個CTC的分析導致PIK3CA突變檢測率更高並且在PIK3CA突變狀態中顯示強烈的患者間的異質性。

HER2致癌基因在大約20％的原發性乳腺癌中被擴增和過表達，並且可以在藥理學上被有效地阻斷。儘管原發性腫瘤目前用於將患者分層進行HER2導向治療，但在遠端轉移和CTC中，與原發性腫瘤相比，在高達30％的病例中，HER2狀態差異不顯著。具有晚期ER陽性/ HER2陰性乳腺癌的婦女中的CTC可以在多個療程后獲得HER2陽性亞群。 值得注意的是HER2 +和HER2-的 CTC可以自發地相互轉化，一個表型的細胞產生相反的子代，提示CTC內的動態功能狀態可能有助於逃避HER2靶向治療，需要新的治療策略。

前列腺癌： 前列腺特異性抗原（PSA）和前列腺特異性膜抗原（PSMA）分別在雄激素受體（AR）激活和AR抑制後上調。有趣的是，基於PSA / PSMA的CTC測量似乎是CTC中AR信號的替代，這些信息可能有助於預測AR治療的結果。 最近針對前列腺癌的研究也證明了mRNA CTCs分析可以揭示藥物敏感性和耐藥性的重要信息。例如，在CTC中缺乏配體結合結構域但保持組成型活性的AR的截短形式的AR-V7的mRNA表達可以預測恩替沙胺和阿維酮酮的抗雄激素治療失敗。

可以在前列腺癌患者的cfDNA中有效鑒定AR基因的突變。 轉基因抗原前列腺癌（mCRPC）中cfDNA的AR基因組分析可以為恩沙拉坦反應和抗性。AR基因突變也可以在來自未行去勢治療前列腺癌患者的富含CTC的外周血樣品中鑒定。檢測到AR突變在35例CRPC患者中有20例：觀察到19個錯義突變，2個沉默突變，5個缺失和1個插入。 最近，來自前列腺癌患者的CTC的全部外顯子測序為腫瘤進展提供了一個窗口。

肺癌： 幾項研究比較了ctDNA和肺組織活檢組織樣本中表皮生長因子受體（EGFR）突變狀態。 在初始試驗中，腫瘤和血漿/血清樣品中EGFR狀態的一致性很高，美國食品和藥物管理局和歐洲藥物在沒有活檢材料的情況下，機構批准的測試可以直接從血漿檢測該臨床情況下的EGFR突變。

來自轉移性非小細胞肺癌患者的CTCs的分析從12例患者中的11例（92％）和匹配的遊離血漿DNA中鑒定出12例患者中有4例（33％）（P = 0.009），CTC中預期的EGFR激活突變。 來自接受酪氨酸激酶抑製劑的患者的CTC中顯示賦予耐藥性的T790M突變。CTC計數的連續增加與腫瘤進展相關，在某些情況下出現另外的EGFR突變。 最近，與通過體內分離捕獲的CTC中可以檢測到與治療決定相關的KRAS和EGFR基因的突變，並在相同患者的原發性腫瘤中得到證實。

結腸直腸癌： 「RAS」野生型結腸直腸癌通常基於抗體西妥昔單抗和帕尼單抗進行EGFR阻斷。 報道了組織中KRAS的突變狀態與結直腸癌ctDNA的高度一致性癌症患者。 NRAS和BRAF突變也是如此; 值得注意的是，在幾種情況下，基於血液的分析檢測到在手術標本中未檢測到的KRAS突變。 這可能反映了在組織活檢中遺漏但被捕獲在ctDNA中的腫瘤異質性，並說明了使用組織作為黃金標準的問題。

圖2：由於人類腫瘤的固有異質性，獨特的耐葯機制可以在單個患者內進行，甚至在個體轉移性病變中發展。 組織活檢本質上不能捕獲這種異質性，而液體活檢可以在空間和時間上更全面地克隆進化。例如，我們描述了轉移性結腸直腸癌患者：用抗EGFR抗體治療后，抗性克隆逐漸出現攜帶抗性突變。 循環的遊離DNA允許識別，追蹤和定量具有不同等位基因的克隆。 監測TP53基因中的莖（截斷）突變跟蹤腫瘤負荷，而損傷特異性突變（KRAS，MAPK）提供治療期間克隆進化的量度。說明ctDNA分析顯示KRAS和NRAS突變在體外和體內EGFR阻斷期間迅速出現，並且可以在放射學檢測複發前檢測到。

結論：將液態活檢用於常規臨床診斷中有哪些要求？

用於確定ctDNA中EGFR突變的前兩個伴隨診斷測試已經被歐洲和美國的監管機構批准。 現在可以在不能獲得組織活檢情況下，使用血液的液體活檢來指導EGFR突變的非小細胞肺癌患者的抗EGFR治療。 雖然這些證明了ctDNA的臨床適用性，但需要進行補充介入研究以證明液體活檢的臨床效用，即其能力指示採取或拒絕治療動作的決定。

組織活檢目前仍然是液體活檢分析的黃金標準或參考，這一概念甚至被監管機構採用批准試驗。然而，使用組織活檢作為參考標準是有問題的。除了活檢並用作參考的病變的腫瘤內異質性之外，ctDNA或CTC可以衍生自未活檢的病變，並且可能含有不同的基因組成。 即使在沒有轉移性病變的患者中通過當前成像模式（階段M0）檢測，隱匿性微轉移可能有助於ctDNA或CTC的集合，因此導致與用作參照的原發腫瘤不同的基因組景觀。

到目前為止，大多數（如果不是全部）基於ctDNA的調查本質上是概念驗證報告。 這些都代表將來研究的基礎，旨在使用液態活檢來改變臨床實踐。 其中，第一個可能是將利用血液而不是組織作為優化個性化治療的主要信息來源的診斷測定。這些將與通過使用液態活檢來監測患有癌患者的MRD的分析相結合。用於篩查目的的液體活組織檢的可能性（非侵入性早期檢測）也是令人著迷的，並且可能吸引未來的突出興趣。

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