Nature文章揭示DHX9與環狀RNA形成的關係

3月29日，Nature雜誌在線發表了馬普學會免疫生物學和表觀遺傳學研究所Asifa Akhtar教授的Letter文章，介紹發現RNA解旋酶DHX9可特異性結合反向Alu元件，參與調節環狀RNA的形成[1]。

該文章的想法怎麼來的？

哺乳動物中存在一種針對雙鏈RNA的效應通路，稱為dsRNA response。目前已知的這一效應機制的相關基因包括ADAR、PKR、Staufen、MDA-5 和 RIG-I。DHX9的基因結構與ADAR和 PKR非常相似，並且DHX9在細胞在內的含量非常豐富，然而關於DHX9在細胞內的作用研究還非常少。因此，作者開展本項研究的切入點正是要揭示DHX9基因的功能。

圖1 DHX9基因結構與ADAR和 PKR非常相似（來自[1]）

文章的主要邏輯思路和結論

DHX9與ADAR和PKR基因如此相似，首先需要分析與DHX9相互作用的RNA序列，找出共性特徵。作者分別用uvCLAP和FLASH進行了分析，表明DHX9與Alu元件有較強的相互作用。由於Alu元件是靈長類特有的，作者用小鼠模型分析到小鼠中DHX9主要與B1元件相互作用。這些SINE元件往往形成特殊的RNA結構，DHX9可以捕獲的Alu元件間距明顯低於未被捕獲的Alu元件間距，說明DHX9實際上是通過結合由反向SINE元件形成的特殊雙鏈RNA結構發揮功能的。反向互補RNA序列是形成環狀RNA的重要原因，作者在敲除DHX9后環狀RNA形成的種類和數量都有非常明顯的增加。有些基因的3』-UTR也帶有反向互補Alu元件，作者通過構建報告基因系統證明了DHX9也參與調節這類基因的功能。很多基因的轉錄后RNA剪接過程會受到Alu元件的調控，作者在DHX9敲除細胞的測序結果中發現了非常多的基因的RNA剪接過程受到了影響，作者也選取了有代表性的CCL25基因進行了驗證。DHX9基因敲除后還會導致細胞出現奇怪的包含多個小的多形性核的巨細胞結構，通過成像學和相關基因的分析，證明是由於DHX9基因敲除后影響了SPC24基因的功能導致的。最後作者還基於SILIC分析了與DHX9相互作用的蛋白，找到了80多個，通過RNase消化對照，絕大部分是藉助RNA的橋接作用在SILIC實驗中被釣取到的，有趣的是ADAR的一種剪切變體ADAR(p150) 是不依賴RNA橋接作用的與DHX9相互作用蛋白。最終通過這一系列的深入分析，作者得出結論，DHX9通過與ADAR(p150)相互作用，協同調節RNA轉錄后加工過程，通過識別以反向Alu序列為代表的反向互補元件形成的RNA雙鏈結構，促進其解螺旋，減少形成環狀RNA的傾向，精密的調節基因轉錄后剪接作用。

下面我們分別詳細介紹本文思路的各個主要部分是如何一步步進行的：

紫外交聯法獲得DHX9相互作用RNA序列信息

作者採用了紫外交聯親和純化（uvCLAP）鑒定與DHX9相互作用的RNA，然後分析這些互作序列的共性。

圖2 兩種紫外交聯技術分析DHX9相互作用RNA序列（來自[1]）

作者發現DHX9互作序列集中在內含子區，大部分富集在Alu元件序列上。

圖3 DHX9互作序列富集在Alu元件上（來自[1]）

作者也用另一種紫外交聯技術（FLASH）驗證了這一結論。兩種方法相互比較並藉助多種分析策略，最終作者得出了DHX9可特異性結合Alu元件的結論。

圖4 兩種紫外交聯分析技術一致表明DHX9傾向於結合Alu元件（來自[1]）

Alu元件為靈長類特有的，在其他物種中DHX9結合什麼序列呢？作者構建了內源DHX9插入3×Flag標籤的細胞，利用uvCLAP分析，表明小鼠中DHX9傾向於結合B1序列元件。

圖5 小鼠中DHX9傾向於結合B1元件 （來自[1]）

DHX9為RNA結合蛋白，Alu元件和B1元件以及果蠅中的roX元件都會傾向於形成特殊的雙鏈RNA結構，從而激發DHX9的功能。在紫外交聯的實驗中，並非所有的Alu元件都會被DHX9結合，會不會是Alu元件的分佈也會影響DHX9的結合？ 於是作者利用工具軟體（YASS）分析了DHX9結合與不結合的Alu元件的分佈狀態，結果表明不被DHX9結合的Alu元件間中位間距達1482nt，而DHX9結合的Alu元件間的中位間距為458nt，差別非常明顯，因此作者認為DHX9結合的是適當間距的Alu元件行車了合適的雙鏈RNA結構。

圖6 DHX9結合的Alu元件間距分析（來自[1]）

DHX9調節環狀RNA的形成

以Alu元件為代表的反向互補RNA序列是環狀RNA形成的重要因素。上面的結果表明DHX9是通過結合合適間距的反向Alu元件發揮功能的，那麼很自然的產生一個問題：DHX9是否調控環狀RNA的形成？DHX9基因RNA干擾的結果表明，DHX9基因敲降后細胞內環狀RNA的種類有非常高的增加，從對照的25658種敲降后猛增至50355種！在DHX9基因敲除的細胞中，可形成環狀RNA的基因產生的環狀RNA甚至增加了四倍！

圖7 DHX9敲降后大大提高環狀RNA形成的種類數（來自[1]）

作者也選取了一些有代表性的環狀RNA進行了QPCR驗證。

圖8 DHX9基因敲降后提高環狀RNA形成數量（來自[1]）

DHX9調控帶反向Alu調控元件的mRNA的功能

有些mRNA的3』-UTR也帶有反向互補Alu元件，作者也分析了DHX9對這些基因的影響，結果表明敲除DHX9能明顯降低攜帶3』-UTR反向互補Alu元件是報告基因的活性。

圖9 熒光素酶報告基因分析DHX9對3』-UTR的反向Alu元件的調控作用（來自[1]）

在DHX9基因敲除的細胞中回補野生型DHX9能恢復其功能，而回補解旋酶功能缺失突變體則不能恢復，這說明DHX9是通過解開反向互補的Alu序列，而不是僅僅結合在上面發揮作用。

圖10 DHX9解螺旋酶功能缺失性突變不能恢復DHX9敲除的影響（來自[1]）

DHX9調控RNA剪接作用

反向Alu元件有助於環狀RNA的形成，也會影響對應的線性RNA的剪接加工過程，表現為掩蓋一些RNA剪接信號或終止信號。DHX9會不會對RNA剪接的過程由影響？作者分析了DHX9敲除細胞中Poly(A)+的RNA-seq情況，結果表明DHX9敲除后，轉錄后剪接過程受到影響的基因非常多，多達5890個基因，對應於9146個外顯子。

圖11 DHX9基因敲除后mRNA的剪接過程受到非常大的影響（來自[1]）

作者挑選了變化最明顯的CCL25基因進行了驗證，表明DHX9敲除后CCL25會明顯上調。對該基因的結構分析表明，DHX9基因敲除后導致的轉錄后剪接/終止信號失效。

圖12 DHX9基因敲除對CCL25轉錄后RNA剪接作用的影響（來自[1]）

DHX9敲除對細胞形態的影響和機制

作者通過顯微鏡觀察，發現DHX9基因敲除后細胞呈現特殊的含有多個小的多形性核的巨細胞狀態。

圖13 DHX9基因敲除后細胞形態的變化（來自[1]）

這與先前報道的細胞「葡萄表型」很類似，從文獻報道的細胞「葡萄表型」相關的153種基因中，作者發現在DHX9基因敲除后SPC24下最為明顯，且該基因的3』-UTR含有反向Alu元件。於是作者就深入分析了DHX9基因敲除對SPC24的影響機制和與細胞表型的關係。證明DHX9基因敲除后的確降低了SPC24基因的正確轉錄產物的生成，導致了所觀察到的細胞形態變化現象。

圖14 DHX9基因敲除后顯著降低SPC24基因的正確剪接產物生成（[1]）

DHX9體內互作蛋白篩選鑒定

DHX9在體內相互作用的蛋白會有哪些呢？作者採用了SILIC實驗進行篩選，共找到80個有較明顯相互作用信號的蛋白，絕大部分為RNA相互作用蛋白，進一步，基於RNase消化對照，證明這些篩選到的互作蛋白大部分是基於RNA橋接實現的。其中ADAR(p150)是直接與DHX9相互作用的。

圖15 DHX9與ADAR(p150)相互作用（來自[1]）

結論：

經過系統的研究論證，作者得出結論：以Alu（靈長類）或B1（小鼠）為代表的SINE元件對基因表達有重要影響，反向互補的SINE元件形成特殊的雙鏈RNA結構，影響線性RNA的剪接和環狀RNA的形成。DHX9通過與ADAR(p150)相互作用，促進這種雙鏈RNA結構的解螺旋，微調控基因轉錄產物的剪接作用和轉錄后產物的功能。DHX9基因敲除後會大大提高環狀RNA形成的數目和種類。

圖16 DHX9調控RNA剪接和功能 （來自[1]）

本文的工作非常細緻全面，實驗設計也非常嚴謹。本文首次系統研究了DHX9在Alu元調控基因轉錄后加工和功能調控中的重要作用，提高了對人類基因組中轉座元件的功能認識，也增進了對反向Alu元件調控線性和環狀RNA形成機制的認識。

本文的結論可以啟發我們如何研究感興趣的基因的線性和環狀RNA產物間相互關係的問題。反向互補序列是環狀RNA形成的重要基礎條件，但同一基因在不同生理或病理條件下產生環狀RNA的效率經常會有較明顯的差別，說明一定存在尚未報道的精密的調控機制，DHX9是不是這一機制的一部分，也未可知。或許可以從DHX9相互作用的蛋白入手找到可能的通路和機制。

環狀RNA和成熟的mRNA可視為統一基因轉錄產物的不同加工終產物，它們之間會不會有相互作用？兩者的形成過程有沒有聯繫？已有少量的文獻報道成熟的環狀RNA與對應的mRNA存在相互作用，但這方面的研究只能算是剛剛起步，人類基因對應的環狀RNA高達十幾萬種，並且還可能會有更多。這麼多種類的環狀RNA背後一定隱藏著很多非常有趣的機制。有待各位同仁們一起努力去揭開它們的神秘面紗。

參考文獻：

1. Aktas, T., et al., DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature, 2017.

文 | circRNA 吉賽生物

本文為作者授權肽度時界發布

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