Nature發布癌症免疫研究重大成果：CRISPR篩選發現免疫治療的奧秘

報道：免疫檢查點抑製劑是一種新型的癌症藥物，目前已被批准用於治療晚期黑色素瘤患者，以及患有某些肺部，膀胱，頭頸部，腎臟和其他類型晚期癌症的患者。一些患者在進行此類治療的時候療效不錯，緩解期延長，但一些患者情況卻不佳。

這是為什麼呢？來自美國國家癌症研究所（NCI）的一組研究人員通過全基因組CRISPR大規模篩選，發現腫瘤中表達特定蛋白編碼基因的患者就能對這種癌症免疫療法做出應答，這也就是說一些癌基因是免疫檢查點抑製劑治療方法的必需元件。

這一研究成果公布在8月8日的Nature雜誌上，張鋒也參與了該項研究。

約翰霍普金斯大學癌症免疫治療研究所主任Drew Pardoll（未參與該項研究）表示，「這是CRISPR文庫篩選技術的一項新穎應用。這項研究驗證了腫瘤對免疫療法做出應答的基因，而且也提出一些意想不到的，有趣的新基因。」

CRISPR篩選技術

作為一種強大的基因組編輯工具，CRISPR-Cas9系統已經迅速發展成為大型的、基於功能的哺乳動物細胞篩選策略。這種新型基因文庫是通過單導向RNA（sgRNA）集合的慢病毒傳遞而構建，指揮Cas9或者抑制dCas9與效應物融合，來研究基因的功能或調節靶細胞的基因轉錄。與RNA干擾（RNAi）篩選相比，CRISPR-Cas9系統不論在功能缺失還是功能獲得篩選中，都表現出更高水平的有效性和可靠性。不同於RNAi策略，一個CRISPR-Cas9文庫可以靶定蛋白質編碼序列和調控元件，包括啟動子、增強子和轉錄microRNAs和長非編碼RNAs的元件。這種強大的遺傳工具，無疑將加速各種生物過程的機理髮現。

在這篇文章中，研究人員希望能確定哪些基因突變，會導致患者對免疫檢查點抑制療法產生抗性，這些基因在功能上也是促進T細胞對腫瘤細胞的識別。為此，NCI的Nicholas Restifo等人構建了包含十萬多個導向RNAs的CRISPR-Cas9文庫，這些導向RNAs能靶向人類黑素瘤細胞中的蛋白編碼基因。

之後研究人員分析了當腫瘤細胞攜帶一種單一突變時，是否能被人體CD8+ 效應T細胞殺死，CD8+ 效應T細胞是一種在免疫檢查點抑製劑療法中被激活的免疫細胞，研究人員通過基因工程，使其能表達一種重組的T細胞受體（具有黑素瘤細胞上的抗體特異性，也就是所謂的新抗原）。由此研究人員發現了對於T細胞介導的腫瘤干擾具有重要意義的554個候選基因，這些基因如果在腫瘤細胞中發生突變，就會通過激活T細胞而產生免疫療法抗性。

這是什麼基因？

通過進一步分析，研究人員還發現這554個基因中有13個是由T細胞分泌的細胞因子：γ干擾素誘導的，之前的研究表明γ干擾素能增強T細胞尋找腫瘤細胞靶標的能力。加州大學洛杉磯分校腫瘤免疫學項目主任Antoni Ribas認為，這些研究結果支持了他的研究團隊和最近另一個關於CRISPR小鼠篩選的研究發現，即γ干擾素在抗腫瘤免疫應答通路中具有重要作用。

今年7月，Ribas等人首次探明了晚期黑色素瘤是如何對免疫療法產生耐藥性的，他們指出一個稱為B2M的基因（編碼抗原提呈蛋白β2-微球蛋白，antigen-presentingproteinbeta-2-microglobulin）改變了免疫系統識別癌細胞的方式。同時另外一組利用CRISPR-Cas9開發了一種新的篩選方法，可用於檢測小鼠中數以千計腫瘤基因的功能。通過這一篩選方法，研究小組找到了一個有望增強PD-1檢查點抑製劑（癌症免疫療法的關鍵成員）有效性的新藥物靶點——Ptpn2。

同樣，在最新這篇文章中，研究人員也將其候選基因與Cancer Genome Atlas資料庫里的36種不同腫瘤類型的突變基因進行了比對，在超過100位患者腫瘤中發現了8個突變基因。

「大多數癌症免疫治療的研究集中在T細胞和其他（宿主免疫細胞），而不是作為靶標的癌症上，但是大多數靶向治療，以及致癌信號研究卻是集中在癌症細胞內在事件中。這項最新成果是分析癌細胞如何對T細胞和其作用因子做出應答反應的一個範例研究，這一領域的研究也越來越多。」

人體APLNR突變

在這些確定基因中，有一個編碼G蛋白偶聯apelin受體的基因：APLNR，之前科學家從未發現其與免疫系統功能相關，在幾種腫瘤類型樣品中發現的APLNR主要是用於調控干γ擾素應答。

研究人員重新分析了兩種黑色素瘤小鼠模型中的人體

突變，並進行了過繼性T細胞治療。結果發現與野生型

小鼠相比，免疫治療的療效更低。

「APLNR能調控腫瘤細胞中的細胞因子信號，從而有助於提高參與抗體加工和呈遞過程的基因的活性，這些抗體也就是T細胞識別的信標，」Restifo解釋說。

這項工作強調了干擾素信號傳導缺陷對癌症免疫治療抗性的影響，但是參與干擾素信號傳導的基因似乎在癌症中並不常突變。

實際上，研究中確定的554個基因中有541個具有除干擾素信號之外的功能。 Restifo說：「我們仍然不清楚我們研究中發現的大多數基因是否能夠幫助T細胞識別腫瘤。」

T細胞激活功能

研究小組還將其鑒定的基因，與此前利用免疫檢測點抑製劑治療患者的204個腫瘤外顯子序列的資料庫進行了比對，從中發現他們篩選出的基因突變會在對抗CTLA4免疫檢查點抗體ipilimumab（品牌名Yervoy）無應答的患者體內富集。而且對免疫治療做出應答的患者體內並沒有出現很多這些基因突變。

這些基因是否能激活T細胞，還有待進一步研究，比如編碼參與胚胎髮育轉錄因子的基因：

，會在黑色素瘤中過表達；編碼Bardet-Biedl綜合征1的蛋白的基因：

也可能在幾種器官發育（包括心臟）中扮演重要角色，其它還有編碼60S核糖體亞基蛋白成分的

和

。

「通過這項研究，我們對癌細胞如何對T細胞作為反應，以及為何產生抗藥性有了更多的了解，」Ribas說。而對於Restifo來說，最終目標是將這些基因用於癌症免疫治療，並將無應答患者轉變為有應答患者。

（生物通：張迪）

原文檢索：

S.J. Patel et al., 「Identification of essential genes for cancer immunotherapy,」 Nature, doi:10.1038/nature23477, 2017.

Mutations Associated with Acquired Resistance to PD-1 Blockade in Melanoma

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