Nature：中美合作首次發現m6A修飾調控T細胞穩態【附專家點評】丨BioArt特別推薦

BioArt按：m6A （N6-methyladenosine，6-甲基腺苷酸）是真核生物mRNA中最常見的一種甲基化修飾，芝加哥大學何川教授首次證明m6A修飾可以被動態調控，暗示其可能具有重要的生理功能【1】。過去五年大量的實驗表明，與DNA以及組蛋白的表觀遺傳修飾系統類似，m6A RNA表觀遺傳修飾系統也包括甲基轉移酶（METTL3、METTL14等）、去甲基化酶（FTO、ALKBH5等）以及識別酶（YTHDC1、YTHDF2等）。此外，m6A修飾還參與調控mRNA代謝的全過程，特別是調控了mRNA的穩定性並且能夠決定幹細胞的分化【2-4】。Nature雜誌最近半年還連續發文報道了m6A RNA修飾在斑馬魚和果蠅體內的功能【5-7】。輔助性T細胞是人體內重要的一類免疫細胞，在人體免疫監視和免疫防禦過程中發揮重要作用。輔助性T細胞在不同的微環境作用下分化為不同的效應亞群，m6A是否參與調控輔助性T細胞的亞群分化和功能並不清楚。8月9日，Nature雜誌在線發表了來自耶魯大學Richard A. Flavell教授實驗室和暨南大學尹芝南教授實驗室合作的題為「m6A mRNA methylation controls T cell homeostasis by targeting IL-7/STAT5/SOCS pathway」的最新研究論文， 首次報道了m6A mRNA修飾在哺乳動物免疫細胞中的生理功能。該項研究發現，m6A通過靶向Naïve CD4 T細胞中IL-7/STAT5/SOCS信號通路中的信號分子mRNA來調控Naïve CD4 T細胞的分化，從而維持免疫系統的動態平衡。METTL3作為重要的甲基轉移酶調控m6A RNA甲基化修飾，在CD4 T細胞中特異性敲除Mettl3基因，Naïve CD4 T細胞的分化受阻，從而抑制了T細胞過繼轉輸誘導的腸炎模型中腸炎的發生。該項研究首次揭示了體內m6A甲基化修飾在T細胞介導的腸炎中的生理功能，為T細胞體內穩態和信號依賴的mRNA的降解提供了新的分子機制。鑒於該工作的重要意義，BioArt特別邀請了上海市免疫研究所的資深研究員李斌老師對該工作進行點評，以饗讀者！

論文解讀：

m6A （N6-腺苷甲基化修飾）是RNA中最豐富、分佈最廣泛的RNA修飾【2】。2011年，m6A RNA去甲基化酶FTO的發現【1】，讓人們重新開始關注RNA甲基化修飾在生理上的作用。近期研究發現，在胚胎幹細胞（ESC）中敲除m6A甲基化酶METTL3后，在誘導分化條件下，ESC仍持續高表達多潛能相關基因（Oct3/4、Nanog、Rex1），無法上調分化相關基因(Gata6、Sox1、Otx2等)的表達，使ESC一直處於多潛能化階段【3,4】。與ESC分化類似，Naïve T細胞可在體內/外特定分化條件下分化為不同的T細胞亞群，但m6A在T細胞穩態和分化中的作用仍然未知。

在這項研究中，研究人員通過構建CD4-Cre

條件性敲除小鼠（以下簡稱KO鼠）系統性地研究了N6-腺苷甲基化修飾調控T細胞穩態的分子機制。該研究發現，分選的Naïve CD4 T細胞在體外相應的細胞因子誘導下，KO小鼠來源的Naïve T細胞分化為Th1和Th17細胞的比例顯著下降，分化為Th2細胞的比例顯著上調，而Treg細胞比例幾乎沒有變化。且在將KO小鼠CD4+CD25-CD45RBhi naïve T細胞轉輸至RAG2-/-小鼠體內后，無法誘導小鼠慢性腸炎。對轉輸至RAG2-/-小鼠體內的細胞進行分析發現：1） KO小鼠Naive T細胞可在RAG2-/-小鼠體內長期存活（至少12周）；2） 轉輸的KO小鼠Naive T細胞無法進行穩態增殖和分化，始終維持Naive T細胞狀態 (

) 。

圖1. Mettl3 KO Naive T細胞轉輸至RAG2-/-小鼠體內不會導致自發性腸炎（a），繼續保持初始狀態，無法進行穩態增殖（b）。

Naïve T細胞的穩態和存活主要受IL-7/STAT5和TCR信號通路共同調控【8】。因此，METTL3的敲除可能影響了IL-7R下游信號分子，從而影響了轉輸的T細胞的增殖和分化。為了驗證這一猜想，分選的WT和KO小鼠的Naïve T細胞體外給予IL-7/IL-2或anti-CD3/CD28刺激，實驗結果表明KO小鼠 Naive T細胞的IL-7信號通路下游的JAK1 和STAT5 磷酸化水平顯著降低，而TCR下游信號分子ERK和AKT的本底磷酸化程度增強。進一步研究發現，KO小鼠 Naive T細胞中，一類細胞因子信號抑制分子（SOCS）家族的mRNA水平顯著上調，這其中包括SOCS1、SOCS3、CISH，而這些蛋白是已知的IL-7信號抑制分子，其中SOCS1還可抑制Ras-GAP的活性, 從而促進ERK和AKT的磷酸化。上述結果揭示了為何KO小鼠 Naive T細胞無法穩態增殖卻可以長期存活，同時也表明，m6A可靶向SOCS蛋白家族，調控IL-7和TCR信號通路，影響Naive T細胞的穩態增殖和分化。

有研究表明，大部分基因（~87%）的mRNA丰度的變化主要是由mRNA的轉錄速率決定的，但小部分基因（~13%）的mRNA丰度是由降解速率決定【9】。這一小部分基因主要為早期快速誘導基因，而SOCS家族的大部分成員屬於IL-7刺激誘導的早期快速誘導基因。然而，T細胞中的m6A其如何選擇性靶向SOCS蛋白家族呢？通過RNA降解試驗以及全基因組測序的s4U-Seq試驗發現: 1） IL-7可誘導SOCS mRNAs的快速降解，解除SOCS家族蛋白對IL-7受體信號通路的抑制作用，促進Naïve T細胞重編程（Reprogram）進而啟動T細胞的增殖、分化；2）m6A介導了一類基因（包括SOCS 基因）mRNAs的快速降解（圖2）。

圖2. m6A控制T細胞穩態分佈的分子機制。 a. Mettl3 KO 初始T細胞內的Socs基因表達升高阻止了IL-7誘導的激活；b.初始T細胞激活的新模型。

機體內T細胞的穩態為機體免疫監視和免疫防禦提供了重要保障。該項研究首次揭示了體內m6A甲基化修飾在T細胞介導的腸炎中的生理功能，闡明了m6A甲基化修飾在調控輔助性T細胞的效應分化中的作用，為T細胞體內穩態和信號依賴的mRNA的降解提供了新的分子機制，並且表明m6A RNA修飾系統可以作為減輕自身免疫疾病的藥物靶點。

據悉，該論文的通訊作者為耶魯大學的Richard A. Flavell教授，李華兵博士及以及暨南大學的尹芝南教授。耶魯大學Richard Flavell實驗室的李華兵博士、暨南大學和耶魯大學聯合培養的尹芝南教授的博士生童吉宇、以及Richard Flavell實驗室的朱書博士為這篇論文的共同第一作者。該工作的一部分受到了國家自然科學基金委重大國際合作項目和「111計劃」的支持。這篇論文的共同第一作者朱書博士現已全職回到科學技術大學任教授。這篇論文的第一作者兼共同通訊作者李華兵博士目前已全職回到上海交通大學醫學院上海市免疫學研究所組建獨立實驗室，繼續開展m6A的後續相關工作。上海市免疫學研究所是由上海市科委、上海市教委和上海交通大學醫學院共建的第一家從事免疫學研究的專門機構，近年來，在中組部/上海市「千人計劃」專家、長江學者講座教授、上海交通大學「王寬誠」講席教授蘇冰所長的帶領下，已經成為的免疫學研究重鎮。值得注意的是，蘇冰教授是耶魯大學博士，2012年全職歸國前是耶魯大學醫學院免疫系的終身教授，期間Flavell教授是他的系主任。源於這一特殊關係，Richard Flavell教授決定在上海交通大學醫學院擔任即將成立的上交大-耶魯免疫代謝中心主任，並且在蘇冰教授和李華兵研究員的協助下在上海交通大學醫學院建立實驗室，直接在指導博士生和博士后，為推動上海市免疫學研究所和的免疫學研究儘力作出貢獻。

李斌丨上海市免疫所余㵑學者，分子免疫學課題組組長，資深研究員，國家「傑青」

Comments：耶魯大學Flavell實驗室李華兵博士、朱書博士與暨南大學尹芝南實驗室博士生童吉宇等密切合作，通過研究RNA甲基化修飾酶類複合體 METTL3/METTL14家族蛋白的體內生理功能，發現T細胞特異性缺失RNA腺苷甲基轉移酶(m6A writer)的小鼠，體內T細胞分化受阻，免疫穩態被打破。其機制涉及到RNA腺苷甲基轉移酶特異性調控「信號依賴性早期反應基因」如SOCS家族蛋白編碼基因SOCS1，SOCS3和Cish轉錄體mRNA的3'UTR的m6A修飾及其mRNA的降解周期被打破,影響到初始T細胞分化發育至關重要的IL-7/STAT5信號通路的激活。該研究發現了m6A mRNA 甲基化的體內生理功能，對研究不同類型mRNA 甲基化的體內調控機制及其在不同組織或發育不同階段的體內生理功能具有開創性意義。

參考文獻：

1Jia, G. F. et al. N6-Methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nature chemical biology 7, 885-887, doi:10.1038/Nchembio.687 (2011).

2Cao, G., Li, H. B., Yin, Z. & Flavell, R. A. Recent advances in dynamic m6A RNA modification. Open Biol 6, 160003, doi:10.1098/rsob.160003 (2016).

3Batista, P. J. et al. m(6)A RNA Modification Controls Cell Fate Transition in Mammalian Embryonic Stem Cells. Cell stem cell 15, 707-719, doi:10.1016/j.stem.2014.09.019 (2014).

4Geula, S. et al. Stem cells. m6A mRNA methylation facilitates resolution of naive pluripotency toward differentiation. Science 347, 1002-1006, doi:10.1126/science.1261417 (2015).

5Zhao, B. S. et al. m6A-dependent maternal mRNA clearance facilitates zebrafish maternal-to-zygotic transition. Nature 542, 475-478, doi:10.1038/nature21355 (2017).

6Lence, T. et al. m6A modulates neuronal functions and sex determination in Drosophila. Nature 540, 242-247, doi:10.1038/nature20568 (2016).

7Haussmann, I. U. et al. m6A potentiates Sxl alternative pre-mRNA splicing for robust Drosophila sex determination. Nature 540, 301-304, doi:10.1038/nature20577 (2016).

8Takada, K. & Jameson, S. C. Naive T cell homeostasis: from awareness of space to a sense of place. Nature reviews. Immunology 9, 823-832, doi:10.1038/nri2657 (2009).

9Rabani, M. et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotech 29, 436-442, doi:10.1038/nbt.1861 (2011).

通訊作者簡介：

Richard A. Flavell教授簡介

耶魯大學免疫學研究處於國際上頂尖水平，引領免疫生物學和免疫醫學轉化領域最前沿的研究。Richard A. Flavell教授領導的團隊代表了耶魯大學最頂尖的免疫學研究力量。Richard A. Flavell教授1970年畢業於英國赫爾大學生物化學專業，獲博士學位。1970-1973年分別於荷蘭阿姆斯特丹大學和瑞士蘇黎世大學開展博士后研究工作。1974-1979年任阿姆斯特丹大學助理教授。1979-1982年擔任英國國家醫學研究所基因結構與表達實驗室負責人。1982-1988年受聘於美國Biogen公司出任總裁。1988年起就職於美國耶魯大學醫學院，是耶魯大學醫學院免疫學系的創始人，擔任免疫學、生物學教授和免疫系主任，並擔任系主任長達28年（1988-2016年）；1988年獲聘為美國霍華德休斯醫學研究所（HHMI）研究員；2002年被耶魯大學授予Sterling講席教授頭銜（耶魯大學教授最高榮譽頭銜）。Flavell教授獲得榮譽眾多，1984年成為英國皇家學會和英國皇家科學研究所成員，2002年入選美國國家科學院院士，2006年入選美國國家醫學研究院院士。Flavell教授發表各類科研論文迄今共計1090篇，因其在免疫及分子生物學領域內取得的突出貢獻而獲得國際上許多頂級獎項，擔任第一屆國際細胞因子及干擾素協會主席（2014-2015），擔任多家國際一流學術期刊編輯，包括Immunity雜誌副主編 (1994年至今)；Journal of Experimental Medicine雜誌編委(2006年至今)；Journal of Clinical Investigation雜誌顧問編輯(2010年至今)等。他同時兼任武漢大學，南開大學，蘇州大學以及美國的Scripps研究所榮譽教授。

Richard A. Flavell教授是世界上最知名的以及高被引的免疫學家之一（H指數高達219，文章引用數至今達179833），科研工作建樹頗豐並繼續活躍在科學界，在分子生物學領域和免疫學領域作出了很多原創性重大貢獻。他是基因內含子的共同發現者之一，首次證明了DNA甲基化會抑制基因表達。在博士後期間首次發展並使用了反向遺傳學研究方法，並在此後的科研生涯中一直積極使用該方法進行生物體內功能實驗。其實驗室致力於研究免疫應答的分子和細胞學機理，為T細胞由前體細胞分化為各類亞群細胞的分子機製做出了主要貢獻；首次發現「接吻染色體」調節基因表達。同時，其實驗室還揭示了通過免疫調控從而抑制自身免疫反應和對病原體過激反應的機制；發現了數個受體家族在固有免疫反應中的作用，包括Toll樣受體(TLR)和胞內Nod樣受體(NLRs)；闡明了Nod2受體及Nalp蛋白在炎症性腸病中的功能。Flavell教授近年來的研究建立了炎性小體、微生物群落和部分慢性疾病之間的關係，證明微生物群落失調將導致炎症性腸病和各類代謝綜合征，例如肥胖、脂肪肝、2型糖尿病等。最後Flavell教授也闡明了TGF-b在免疫反應調控中的作用， 為自身免疫疾病和腫瘤免疫逃逸的進一步研究和治療奠定了堅實基礎。

人才培養方面他培養了一大批活躍在當今國際免疫學界知名的免疫學家，其中來自的免疫學家代表有清華大學醫學院院長董晨教授，美國紀念斯隆-凱特琳癌症中心的李明教授，美國聖猶達兒童研究醫院的遲洪波教授，美國北卡羅來納大學醫學院萬誼松副教授，美國匹茲堡大學的Binfeng Lu副教授等。Flavell教授在過去的數年間已經和的科學家有非常廣泛的合作，例如和尹芝南教授在暨南大學的合作。為了繼續擴大培養來自的人才，Flavell教授即將在上海交通大學醫學院與「千人計劃專家」 蘇冰教授共同組建上交大-耶魯免疫代謝中心，直接在培養博士生和博士后，為的免疫學研究貢獻力量。

實驗室網頁： https://medicine.yale.edu/lab/flavell/

李華兵博士於南開大學大學部(1999-2002)和碩士(2002-2005)畢業后，先後在國外知名頂尖實驗室接受嚴格的系統科學訓練， 完成博士學位研究（2005-2011, 博士生導師：Vincenzo Pirrotta, Rutgers University，國際知名表觀遺傳學家）與博士后研究訓練（2012-2017， 博士后導師：Richard Flavell, Yale University，國際著名免疫學家/美國科學院院士）。在表觀遺傳學和T 細胞生物學領域，李華兵研究員作為第一作者，共同第一作者和共同通訊作者已在Nature, Science 等國際一流期刊發表研究論文10 余篇。李華兵博士於2017年8月正式全職在上海交通大學醫學院免疫學研究所任職表觀遺傳免疫學課題組組長（研究員, Principal Investigator)。李華兵研究員獨立的課題組已經得到上海交通大學醫學院以及上海市第一人民醫院的有力支持。同時，李華兵研究員將和耶魯大學Richard Flavell院士以及「千人計劃」專家蘇冰教授共建實驗室／上交大-耶魯免疫代謝中心。

尹芝南教授， 暨南大學生物醫學轉化研究院院長,國家」傑出青年基金」獲得者，教育部「長江學者」特聘教授,科技部重大科學研究計劃 (973) 首席科學家， 國家人力資源和社會保障部「高層次海外留學歸國創業人才」和新「百千萬」人才工程「有突出貢獻中青年專家」。2013年7月起作為廣東省第四批引進「創新創業團隊」帶頭人被引進到暨南大學。主要研究方向為γδ T細胞的分化發育及其在腫瘤免疫、肝炎和腸道菌群調控中的作用，共發表文章106篇，其中以通訊或共同通訊作者發表文章57篇。尹教授與Flavell 教授合作多年，以共同作者聯合發表論文十多篇。該工作受到了國家自然科學基金委重大國際合作項目的支持。

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