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記者：歐陽博士，5月30號Nature Methods上的一篇「Unexpected mutations after CRISPR–Cas9 editing in vivo」掀起軒然大波，短短几天，科學界已經是山雨欲來，無人不在談論這篇文章。CRISPR為什麼有這麼大威力？您能否先簡短介紹一下這項技術的由來？歐陽博士：好的。20年前日本科學家石野良純在克隆一個目的基因時偶然發現一種特別的重複序列，隨後的10年研究人員一直在試圖破解這種存在於很多細菌和古細菌的神秘序列，並冠以CRISPR這麼個古怪的名稱，直到10年前它的神秘面紗才開始被逐步揭開，原來它是一種以病毒DNA序列為精準打擊對象的導彈防禦系統。近幾年以MIT張峰實驗室為首的科學家把這種進化論產生的生物武器用在各個物種的基因改造上並把它發揮到了極致，從果蠅到斑馬魚到老鼠到猴子，我們的工具箱里突然多了一種便捷高效的基因組編輯器，一種生命科學研究前所未有的利器，也讓我們的科學家插上了想象的翅膀，我們甚至可以想象利用這把利器來糾正人類的基因缺陷。投資人聞訊趕到，把大筆的錢投給了科學家創辦的公司，有的公司甚至成為公眾公司，很快老百姓也知道了，把更多的錢投給了他們，幻想著在不遠的將來收穫巨大的利益。這大概就是為什麼CRISPR如此威力巨大。記者：說起CRISPR的脫靶效應，這早已不是什麼新聞了，一直以來脫靶似乎也沒有那麼可怕啊？歐陽博士：你說的不錯，從CRISPR出道的第一天，關於它脫靶效應的正反文章就層出不窮，彷彿是一場攻防戰，一方說有問題，另一方說問題不大、我有辦法。最後的輿論導向彷彿是說CRISPR的脫靶效應在可控範圍，而且張博士有預測脫靶效應的免費神器，只要大家遵照張博士的指引就無大礙，大家盡可放心使用。記者：可是與以前任何一次不同，這篇文章似乎造成了恐慌，喊了那麼多次狼來了，為什麼這次人們才意識到狼真的來了？歐陽博士：你用『恐慌』一詞一點不為過，這篇文章一出，美國納斯達克上市公司CRISPR Therapeutics的股價就應聲下跌，我們公司一天之內收到N個客戶電話詢問我們對他們CRISPR項目的看法，並尋求預案。因為這次發現的問題徹底顛覆了之前大家對CRISPR脫靶效應的普遍看法。最突出的問題是，之前大家關注的脫靶主要是插入/缺失突變indel（insertion & deletion），而這次發現最多的脫靶卻是點突變SNV（single-nucleotide variant），而且每隻鼠有大約1700個點突變加上100多個indel。更匪夷所思的是，這些SNV和indel發生的位置都不在預測出來的脫靶位點上。記者：是啊，1700個點突變，這麼顯而易見的事情，怎麼現在才被發現？歐陽博士：這個我也感到很不可思議。我的猜測是，大家一直沒有往這個方向想，而且之前的測序深度不夠，沒有找到更可靠的技術發現點突變,並且研究者的關注點集中在預測出來的脫靶位點可能發生的indel。這次用的是50X的深度測序，而且關注點沒有局限於脫靶位點和indel，而是拓展到全基因組的各種突變，問題就顯現出來了。記者：脫靶不是可以用MIT張峰博士的公式和他們實驗室的網站預測嗎？如果gRNA設計得當，不應該有這麼多脫靶啊，我聽說很多人在質疑gRNA的設計有問題。歐陽博士：gRNA的設計確實直接影響脫靶，但不管這次的gRNA是如何設計的，我們的預測神器完全失靈了，預測出來的前50個脫靶位點沒有一個發生脫靶。我們原來的認識是：脫靶風險是與gRNA和基因組相關位置之間的同源程度成正比的，這一次我們完全沒有看到這種關係，這彷彿是要逼我們重新回到原點，重新審視脫靶的機理，原來的認識可能完全是錯誤的。記者：過去短短几年，CRISPR技術席捲了整個生命科學界，甚至進入了醫療領域，這篇文章應該是潑了一盆冷水啊！歐陽博士：確實如此，至少在醫療領域我看不到近期內的應用前景。目前CRISPR臨床應用的安全性是完全不具備的，我們必須投入巨大的資源去把脫靶的真正原因找出來，並設計出有效對策。但我相信這項技術在科研上仍然不失為一個有用的工具，下一步我們必須找出問題，解決問題。記者：這篇文章是在小鼠上用CRISPR技術做基因突變，暴露了其嚴重的脫靶效應，但即使如此，我們是不是仍然可以通過一些辦法來區分我們設計的基因突變與脫靶突變，繼續用CRISPR在小鼠上做基因功能研究？歐陽博士：脫靶突變給小鼠模型帶來的最大問題是我們不知道一個模型的表現型是我們設計的定點基因突變造成的還是我們不知道的某一個脫靶突變造成的。原則上來說，有兩種傳統辦法可以幫助解決這個問題：一個是通過與野生鼠交配去除模型鼠中的脫靶突變，只剩下我們設計的基因突變；另一個是針對同一個模型多做幾個line的鼠，看它們的表現型是不是一致的，如果一致，那這表現型就比較可能是我們設計的突變造成的。不幸的是，這篇文章的數據告訴我們這兩種傳統辦法都無法解決CRISPR脫靶突變的問題。單說這1700個點突變和100多個indel，分佈在每條染色體上平均有好幾十個，通過與野生鼠交配去除這些突變是很困難的，因為每一代交配發生在每一條染色體上的同源重組平均也就不到一次，即使把這個突變數降低一個數量級，通過幾代的交配來去除，仍然是非常困難的。更要命的是，這篇文章發現分別在兩個line的老鼠上的這大約1700個點突變和100多個indel大部分都是相同的，所以通過多拿到幾個line的小鼠並得到相同的表現型來說明該表現型來自我們設計的基因突變而非脫靶突變是難以成立的，因為不同line的脫靶突變很可能也是一樣的。當然深度的二代測序可以告訴我們脫靶的真相，但這太貴太耗時了，也不能去除脫靶突變。記者：那用CRISPR做小鼠的基因突變還可行嗎？歐陽博士：與傳統的ES細胞基因打靶技術製備基因工程小鼠相比，CRISPR技術的最大優點是快捷和低成本。但如果脫靶的問題不能解決的話，用該方法來製備基因工程小鼠顯然遠遠沒有ES基因打靶可靠，尤其是像條件性基因敲除（cKO）這樣複雜昂貴的項目，實在不建議用CRISPR，因為不用花多得太多的代價和時間，完全可以用ES打靶這個久經考驗的金標準。我們兩年前推出的TurboKnockout技術平台，在傳統ES基因打靶上引入了兩項重大技術革新，進一步壓縮了ES打靶的周期和成本，是加大了這個金標準的優勢。我們的人工智慧設計網站更是簡化了方案的設計，我們的技術完全可以彌補CRISPR的不足。記者：非常感謝您再次接受我們的採訪。歐陽博士：不客氣，我也很榮幸！歐陽應斌 博士 高級科學家現任賽業生物科技技術副總裁、高級科學家。研究方向：主要負責轉基因鼠及基因敲除小鼠平台的管理及優化歐陽應斌（Marvin Ouyang）於1997年開始就職於美國Oklahoma醫學研究基金會，擔任高級科學家，成功發現、純化並克隆了兩種硫蛋白轉移酶，成功建成基因敲除小鼠模型。2002年擔任美國Thios生物製藥公司生物部高級科學家，推動了硫酸轉移酶小分子抑製劑及重組抗體製藥的研發。從2004年開始擔任美國Taconic生物科技公司分子生物學部主管，率領十餘位科學家成功開發建成四百餘種轉基因小鼠及大鼠實驗動物及疾病模型。在PNAS、Mol Cell Biol.、J. Biol. Chem.等高水平雜誌發表論文10餘篇。歐陽博士於2012年加入賽業生物科技（ Cyagen Biosciences）公司，主要負責轉基因鼠及基因敲除小鼠平台的管理及優化。賽業生物科技簡介賽業生物科技集團是全球領先的多元化跨國生物科技實體，2006年成立於美國，區總部設立在廣州，並在蘇州設有子公司，北京、上海、武漢、重慶等地均有辦事處。目前員工人數達400餘名，總規模超22000平方米，業務經營範圍涵蓋模式動物、細胞生物學、分子生物學、生物信息學等生命科學領域的多個分支學科。作為全球領先的轉基因/基因敲除模式動物商業技術平台，賽業模式生物研究中心達10000平米，其中包括5000平米的SPF級動物實驗室，配備有IVC和EVC飼養設備超過500套，可養殖SPF級大小鼠近30000籠，動物種群規模超過15萬隻。每年可構建基因敲除鼠、轉基因鼠模型10000例以上，學術引用累計超過1200篇，是目前國際上最主要、最被認可的基因工程模式動物商業服務平台之一。自主開發的全球首款功能強大的在線載體設計工具VectorBuilder，每年可定製載體超30萬個，徹底顛覆生物技術領域傳統格局，打造載體構建金標準和新模式。2009年，賽業通過ISO9001:2008認證並於2012年順利通過複審，確保向廣大專家學者提供的所有產品和技術服務符合國際標準。AAALAC認證的順利通過，使賽業成為華南地區極少數個獲得國際實驗動物評估和認可委員會國際認證的單位之一。這不僅是實驗動物質量和生物安全水準的象徵，更是國際前沿醫學研究的質量標誌。賽業公司目前在美國加州Santa Clara 建立起活體實驗鼠檢測、隔離中心，成為國內唯一一家具有活體實驗鼠類出口能力的生物企業；通過國家出入境檢驗檢疫部門的考核，成為華南地區第一家生物材料出入境綠色通道試點單位，加速了實驗動物出入境審批流程，並進一步提升了賽業模式動物中心國際服務的能力。目前公司的產品和技術服務已為全球數百個頂尖生命科學實驗室和跨國製藥公司提供了幫助，秉承著「為生物科技創造無限可能」的企業願景服務於全世界的科研學者！