如何測量分子的「力量」？| 深度好文

細胞中的蛋白質結構無時無刻不在經歷和創造著微小的力，而科學家正在學習如何在微觀尺度上繪製這些力量。

新工具有助於揭秘引導胚胎發育和腫瘤生長等細胞過程的神秘力量。

在顯微鏡下，細胞通常是靜態的，細胞是生物結構的固體元素。然而在現實中，細胞卻是動態的結構，它們會在密閉環境中相互推搡。細胞會擠壓、伸展、彎曲和拉動周圍環境，並在這些過程中產生作用力。這些力是非常小的——大概在皮牛（10-9N）級別，大約只是一隻回形針十分之一的重量。但它們可以產生深遠的生物學影響。快速增長的胚胎中的力可以改變細胞的發育程序，告訴細胞何時停止分裂，並開始轉化為腦或骨骼。

蘇格蘭科學家 D'Arcy Thompson 在《生長和形態》（On Growth and Form）一書中提出，物理力量影響細胞功能。他寫道：「細胞和組織、殼和骨骼、葉子和花朵是物質的很多形式。因此它們遵循物理學的規律。」

Thompson 的理論為力學生物學（Mechanobiology）的大量實驗研究鋪平了道路。德國慕尼黑馬克斯 - 普朗克生物化學研究所（Max Planck Institute of Biochemistry）細胞力學研究者 Carsten Grashoff 指出，力學生物學是一個非常古老的領域，只是長時間被忽視了。在某種程度上，這是因為研究人員缺乏精確測量分子尺度力的技術。

但現在，情況大不相同，一些創新工具的問世為這些問題的研究奠定了基礎。科學家們可以使用這些工具來繪製傷口癒合過程中，皮膚細胞向前爬行時，蛋白質的伸展和放鬆產生的力。但問題仍然存在——研究人員仍然很難從隨機生物雜訊中分辨出細胞力，而且還未確定這些過程在活體的複雜環境中如何發揮作用。但是，通過將 「力學生物學」 工具與其它遺傳和生物化學工具結合起來，研究人員可以開始了解力如何被轉化為功能。

加州斯坦福大學（Stanford University）機械工程師 Beth Pruitt 表示，生命過程不僅僅是生化信號通路。當你拉一個蛋白質時，你可以打開或關閉一個結合位點，決定細胞內的某個分子程序。

牽引力顯微鏡

細胞主要通過嵌入在細胞膜上的蛋白與環境相互作用，這是細胞力產生和解讀的關鍵。一些蛋白質通過液體的流動而被 「推」，如血管中細胞表面的蛋白質；而另一些蛋白質在細胞被鄰近細胞碰撞時，或與鄰近蛋白接觸時，產生張力相關信號。

一種名為牽引力顯微鏡（traction force microscopy, TFM）的方法在 20 世紀 90 年代問世，並為該領域提供了第一個真正的、量化細胞力的工具。例如，1999 年，當時在伍斯特馬薩諸塞大學醫學院（University of Massachusetts Medical School）的 Yu-Li Wang 和波士頓大學（Boston University）的 Micah Dembo 將一種名為成纖維細胞的結締組織細胞接種到塗覆了熒光珠的凝膠狀材料上。隨後他們發現可以通過測量熒光珠的位移，使用 TFM 推斷這些細胞產生的力。德國埃爾朗根 - 紐倫堡大學（Friedrich Alexander University of Erlangen-Nuremberg）的生物物理學家 Ben Fabry 指出，這就像是彈簧。你在彈簧上放置一個重物，只要已知彈簧的剛度，你就可以通過測量形變，算出重物的重量。

TFM 已經成為研究單個細胞和組織樣片中互相連接的細胞的標準方法。馬里蘭州貝塞斯達國家心臟肺血液研究所（National Heart, Lung and Blood Institute）的 Clare Waterman 使用 TFM 來研究細胞遷移。細胞遷移過程很大程度是由黏著斑（細胞和細胞外基質連接的媒介）與周圍細胞外基質互動產生的力來推動的。

Waterman 的團隊增加了用於 TFM 成像的熒光珠數量，提高了圖像的解析度。她表示她們可以在每個黏著斑下放置 50 個標記，所以解析度可以達到亞微米級別。Waterman 的小組使用這種方法來研究粘著點產生的力如何觸發分子事件，而這些分子事件在胚胎髮育過程中協調定向細胞運動。

當然，響應細胞運動、多維度遷移的熒光珠遠比單一維度變化的彈簧要複雜的多。儘管現代計算方法已經大大降低了這些數據的解讀難度，但 TFM 還需要更強大的超級計算機來解讀數據。即使有了超級計算機，將熒光珠位移數據轉換成力測量並不容易，並且存在許多潛在錯誤的來源。Waterman 指出，如果有另一個細胞反向拖動該熒光珠，那麼看起來，該熒光珠就沒有發生位移，沒有受到力。另外，如果熒光珠的位移過大，超出了一個細胞的邊界，那麼就很難判斷該熒光珠的原始位置。

其他團隊將 TFM 擴展到三個維度，以更好地反映生物現實。例如，Fabry 等人開發了一種在膠原蛋白（細胞外基質的主要蛋白成分）構成的凝膠上跟蹤細胞力的 3D TFM 方法。該團隊能夠探索乳腺癌細胞的形狀、細胞產生的力、在 3D 組織中移動的速度和方向之間的關係——模擬乳腺癌的轉移過程。

但這一方法對分析和計算的要求非常高。Fabry 指出，膠原蛋白是一種非常麻煩的材料——它的形變是非常非線性的。如果你稍微拉伸一下膠原蛋白，它還是柔性的；但如果你多拉伸一點，它就變成剛性的了。

為了解決這個計算負擔，新澤西州普林斯頓大學（Princeton University）生物醫學工程師 Celeste Nelson 在她的器官發育研究中選擇了較低解析度的方法。她們關注的是在數百或數千個細胞的整體中找到力量的相對差異。然而，力的產生本質上是動態的，因此需要在多個時間點收集這些 3D 數據，此時，數據處理就成了大問題。

微型陣列

另一些研究人員則另闢蹊徑，選擇使用各種聚合物模製的小型、精確設計的晶元，這些晶元可提供細胞力的直接讀出。馬薩諸塞州波士頓大學（Boston University）的生物工程師 Christopher Chen 等人開發了一種廣泛使用的設計——一種稱為 PDMS 組成的彈性材料。該材料商有一系列柔性小柱子，就像牙刷上的刷毛。這些 「微柱」 頂端塗覆了 ECM 蛋白質，以便與細胞形成連接。Chen 表示，這些微柱基本上就像迷你彈簧一樣。Chen 實驗室的前博后、現在在密西根大學（University of Michigan）大學使用類似晶元研究人類幹細胞的 Jianping Fu 指出，通過測量偏差，研究者可以識別和測量細胞在單個支柱上施加的力。

晶元上微柱的歪斜是可測量的，並可與細胞蛋白質支架進行比較。

微型陣列數據比 TFM 實驗的結果更容易解讀，並且需要的計算分析相對少。而且這種晶元的生產也相對簡單。並且微型陣列也與熒光顯微鏡兼容，這有助於從分子層面研究產生細胞力的事件。然而，這些陣列強化了細胞與其底物之間的特異和非自然的相互作用模式。這些相互作用模式取決於微柱的分佈和尺寸，並且可能和細胞在活體內的作用模式大不相同。

研究人員還可以通過操縱微柱陣列的設計來定製微柱表面。微柱越粗，越牢固；微柱越高，越細，對力的反應更為敏感。微柱表面的剛度變化可以引發細胞骨架（細胞中的蛋白纖維網架體系，幫助細胞傳遞和響應力）的大量重組。這又可以影響細胞的增殖、運動和成熟。

例如，Fu 發現，表面剛性與成體幹細胞分化之間存在關係。樹樁一樣的微柱難以彎曲，但附著其上的幹細胞趨向於分化成骨細胞。如果微柱非常高，那麼附著其上的幹細胞傾向於分化成脂肪細胞。通過精確調控設計，Fu 的團隊神值可以開發出一種誘導人類胚胎幹細胞發育成功能性脊髓運動神經元的微型陣列。

微小拉力

其他研究人員則使用張力發生變化時發出熒光信號的分子感測器來研究蛋白質或蛋白質複合物施加的力。這種感測器通常基於 Förster 共振能量轉移（Förster resonance energy transfer, FRET）原理，其中一個熒光分子或熒光團激發另一個熒光團——但僅當它們非常接近時。

遷移中細胞施加的牽引力圖譜。

Grashoff 是夏洛茨維爾大學（University of Virginia）生物醫學工程師 Martin Schwartz 實驗室的博士后。他與同事一起開發了第一個基於 FRET 的張力感測器，該論文於 2010 年發表。Grashoff 等人想到，可以使用蜘蛛絲中的那種彈性蛋白，把兩個熒光團連在一起。當有機械張力時，該蛋白會伸長，釋放的 FRET 信號就會減少。未受到拉力時，該彈性蛋白質會形成一個緊湊的線圈，但任何輕柔的拉力都可以拉伸該蛋白，並將兩個熒光團分開。

作為概念證明，Grashoff 和 Schwartz 用他們的感測器研究黏著斑蛋白（負責連接細胞骨架與細胞外基質的黏著斑的成分之一）。當細胞中表達感測器蛋白時，他們觀察到，在細胞遷移過程中，隨著黏著點的組裝和分解，黏著斑蛋白受到皮牛尺度的力變化。

原則上，FRET 感測器可以插入到不同的蛋白質中，以獲得其它難以收集的測量結果。例如，目前幾乎沒有工具可以量化細胞在組織中彼此推動和拉動的力。斯坦福大學（Stanford University）化學工程師 Alexander Dunn 等人通過將 Grashoff 和 Schwartz 的 FRET 感測器整合到上皮細胞鈣粘蛋白（E-cadherin 是將細胞連接在一起的蛋白質）中來測量這些力。

FRET 感測器也可以整合到其它連接蛋白質中，同時也使研究人員能夠微調感測器的靈敏度。Grashoff 指出，他的 FRET 感測器可以選擇性地檢測 1-12 個皮牛的力，但仍有改進的餘地，因為細胞內蛋白質可能會受到高達 20-30 皮牛的力。

但是這種感測器的設計和驗證是勞動密集型的。除了力檢測之外的原因（如降解），感測器可能會 「變暗」。FRET 信號也可能具有挑戰性，需要仔細測量以消除雜訊，並且將大體積的感測器植入到功能強烈依賴於結構的蛋白質中，會有一定的影響，因為這樣可能會影響蛋白的功能。Grashoff 表示，你很難預測植入到蛋白中的效果，感測器干擾了蛋白功能可能不是大問題，但前提是，你要知道干擾有多大。

其他團隊使用不需要植入到蛋白質中的感測器來測量細胞外力。喬治亞州亞特蘭大埃默里大學（Emory University）生物物理學家 Khalid Salaita 的團隊研發了幾種這樣的探針，其中一端固定在固體表面上，如載玻片，另一端則與感興趣的細胞表面蛋白連接。在探針這一端和蛋白之間還有各種各樣的連接分子，對不同程度的力作出響應。Salaita 指出，聚乙二醇聚合物就像煮過的義大利麵條，隨便一個捲曲都可以被拉伸，而 DNA 也具有這種固定的二級結構（螺旋式結構）。

他的小組還使用了一種衍生自肌聯蛋白（高度彈性的分子，在肌肉中產生彈性的捲曲）的連接分子。Salaita 表示，這個感測器就像是一個自然衍生的、能承受更大力的彈簧。這些基於肌聯蛋白的感測器足夠強大，可以測量細胞通過整合素蛋白（黏著斑中可以產生幾十皮牛的成分，幾十皮牛足以打斷脆弱的 DNA 雙鏈和聚合物類的感應器）對其環境產生的拉力。整合素基本上是一種強力抓鉤，可以讓細胞對周圍環境產生巨大的力。

臨床意義

檢測細胞內的力本身就是一個大成就。Salaita 認為，在單細胞水平測量力可以幫助科學家開發更直接干擾腫瘤進展的物理機制的藥物。他還指出，癌細胞的遷移和入侵是最致命的，如果你可以關閉癌細胞遷移的機械過程，同時保證藥物無細胞毒性，那麼這就是一種更精準的腫瘤治療方法。

然而，許多生物學問題需要在組織或器官尺度上進行探索。Nelson 認為，通過離體細胞來預測組織非常困難，但單個細胞的連接對組織中的力的產生和傳遞是必要的。

在她的許多實驗中，Nelson 使用工程化上皮組織，為研究器官形成所涉及的力提供了可控的、可重現的模型。其他團隊則使用幹細胞產生專門的組織；例如，Pruitt 使用幹細胞分化得到的心肌細胞來研究心臟病的機械生物學作用。Nelson 表示，我們有這樣的工具，可以從人類細胞中產生心肌細胞，並在單細胞和微量組織中應用和測量力、位移和伸展。

不過目前的工具還遠遠不夠。大多數力測量實驗仍然非常耗時，這限制了其在需要對大量細胞進行并行分析的研究（例如藥物篩選）中的應用。Fabry 的團隊正在開發自動化和加速 TFM 的方法。他們想同時測量 3D 組織中數百或數千個細胞的響應。

測量生物體內的細胞力也是一個重大挑戰。FRET 感測器是一種解決方案，加州大學聖巴巴拉分校（University of California, Santa Barbara）的機械工程師 OtgerCampàs 等人最近設計了另一種解決方案。他們往生物體組織中注射熒游標記油滴，油滴中含有與細胞表面結合的蛋白質。通過記錄這些液滴在細胞之間的空間中的變形情況，便可以計算導出細胞在液滴上施加的 3D 力。

也許最根本的是，需要一些實驗技術，使科學家更精確地操縱力響應分子。例如，滅活單個黏著點的能力與遺傳學家敲除單個基因的方式類似，可以揭示分子力在時間和空間上的分佈狀態如何改變它對細胞的影響。Nelson 指出，這可以讓他們直接回答很多現在還無法解答的問題。

原文檢索： Michael Eisenstein. (2017) A measure of molecular muscle. Nature, 544(1038): 255-257.

張潔 / 編譯