張鋒Nature Methods新成果！這次無關CRISPR，而是一項測序技術……

CRISPR先驅張鋒每年都會發表大量與基因編輯相關的研究成果，然而，這位大神所涉及的領域遠不只「魔剪」。上個月，在先後發表了2篇與CRISPR相關的Nature后，月底，他又在Nature子刊上發表了一項與測序相關的新成果。研究中，科學家們對去年在1篇Science論文中提出一項單核RNA測序技術進行了重要的改進。

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上個月，在先後以共同作者以及共同通訊作者的身份發表了2篇 Nature后，8月28日，CRISPR先驅張鋒又在Nature Methods雜誌上發表了一篇新論文。值得一提的是，該成果與魔剪CRISPR無關，而是在描述一種改進的單核RNA測序技術（single-nucleus RNA sequencing）。

在正式介紹這項新成果前，我們先回顧一下與這篇論文相關的去年7月發表在Science雜誌上題為「Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons」的成果。張鋒與Aviv Regev是這一研究的共同通訊作者。

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每一個細胞，不管看起來與它的「鄰居」多麼相似，但都有自己響應環境的方式。這種獨特性是由基因表達決定的。每個細胞中的基因如何表達決定了它在人體中的職能。

在過去的幾年中，單細胞測序技術飛速發展，使科學家能夠以前所未有的解析度觀察細胞內的基因表達。藉助這一變革性的技術，研究人員能夠檢測細胞群的異質性，鑒定罕見細胞，觀察不同細胞類型之間的相互作用，更好的了解這種互相作用對健康和疾病的影響。

在這篇Science論文中，利用Div-Seq（which combines scalable single-nucleus RNA-Seq (sNuc-Seq) with pulse labeling of proliferating cells by EdU）技術，科學家們對增殖的單個細胞進行研究。結果發現，sNuc-Seq和Div-Seq不僅能夠敏感地鑒定出密切相關的海馬細胞類型，還能夠追蹤新生神經元的轉錄動力學。研究人員還利用Div-Seq鑒定和描述了成人脊髓中罕見的新生GABAergic神經元。論文結論稱，sNuc-Seq和 Div-Seq為多種多樣複雜組織的無偏差分析開闢了道路。

論文的共同第一作者Naomi Habib說：「我們的方法使得探索複雜的組織變得更加簡單。很重要的一點是，它適用於冷凍或固定的組織，這為研究人類樣本提供了可能。Div-Seq技術還為觀察成人神經形成的罕見過程和其它再生過程提供了新的方法。同時， 這一技術還可以用於觀察特定組織中正在分裂的細胞，追蹤基因表達的變化。」

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在這篇最新的Nature Methods論文中，科學家們克服了阻礙sNuc-Seq廣泛應用的關鍵「絆腳石」：規模。張鋒與Aviv Regev也是這一研究的共同通訊作者。

具體來說，研究描述了一種被稱為DroNc-Seq的技術。它是融合了sNuc-Seq和微流體（microfluidics）的一種單細胞表達分析技術，能夠在結構複雜的組織中允許大規模的基因表達平行分析。

過去，科學家們一直在努力在單細胞水平研究來自複雜組織（如大腦）的神經元和其它細胞的基因表達。然而，將細胞分離出來的這個程序影響了細胞的RNA含量。此外，這些過程也不適用於冷凍保存的組織。sNuc-Seq技術通過利用從細胞中提取出的單個細胞核作為起始點（by using individual nuclei extracted from cells as a starting point），成功繞過了這些問題。

不過，sNuc-Seq技術也有缺陷。它是一種低通量的技術，只能使用96或384孔板來自收集和運行樣本。為了使sNuc-Seq能夠同時有效地研究數以千計的細胞核，研究人員想到了微流體技術，進而開發出了升級版的DroNc-Seq。

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事實上，DroNc-Seq的開發靈感來自一個稱為Drop-Seq的單細胞RNA測序技術。該技術將單個細胞與DNA條形碼串珠封裝在微滴中（encapsulates single cells together with DNA barcoded-beads in microdroplets），極大地促進了表達分析，並降低了成本。相關成果於2015年5月以「Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets」為題發表在Cell雜誌上。

Credit : Susanna M. Hamilton, Broad Communications

為了測試升級版DroNc-Seq的準確性和速度，研究小組使用小鼠細胞系和大腦組織進行了驗證。他們還將DroNc-Seq應用到通過Genotype-Tissue Expression （GTEx）Project收集的人類大腦組織中。結果發現，他們能夠識別大腦中神經元、膠質細胞和其它類型細胞的表達特徵，並且能區分密切相關的細胞亞型。

Single-nucleus RNA sequencing (sNuc-seq) profiles RNA from tissues that are preserved or cannot be dissociated, but it does not provide high throughput. Here, we develop DroNc-seq: massively parallel sNuc-seq with droplet technology. We profile 39,111 nuclei from mouse and human archived brain samples to demonstrate sensitive, efficient, and unbiased classification of cell types, paving the way for systematic charting of cell atlases.

張鋒實驗室的Naomi Habib也是這篇Nature Methods論文的共同第一作者。她在去年的Science論文發表時曾表示，他們的方法還支持很多應用，比如，描繪大腦中對學習和記憶非常重要的區域的細胞多樣性。新的改進將推動這一技術更廣泛地應用。

參考資料：1）Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons

2） Single-nucleus RNA sequencing, droplet by droplet

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