Nat Commun：最小基因剪刀問世！

導語

基礎科學研究所（IBS）與 KIM Eunji（ToolGen Inc.）和 KIM Jeong Hun（首爾國立大學）合作，設計了迄今為止最小的 CRISPR-Cas9，通過腺相關病毒（AAV）將其遞送至肌細胞和小鼠的眼睛，並用它來修改致盲基因。這種 CRISPR-Cas9 系統源自空腸彎曲桿菌（CjCas9），預計將成為一種有效的「不可排除」疾病的治療工具。該研究發表在 2 月 21 日的《Nature Communications》上。

CRISPR-Cas9 是分子生物學家的流行詞。 它能夠高效、簡便和精確的編輯基因。 Cas9 是「基因剪刀」蛋白質：它在嚮導 RNA 所指示的精確位置上進行靶基因切割。 為了使 CRISPR-Cas9 複合物到達靶 DNA，其必須通過質粒或病毒遞送。 IBS 中心基因組工程中心主任 KIM Jin Soo 解釋說：AAV 是一種在體內表達目的基因的有效和安全的載體，並已廣泛用於基因治療。 自然地，Cas9 被幾種細菌用作免疫武器; 需要切割可能損害細菌的病毒 DNA。 最常見的 CRISPR-Cas9 技術使用化膿性鏈球菌的 Cas9（SpCas9）。 然而，該蛋白質由 1,368 個氨基酸製成，因為其太大而不能在 AAV 中遞送和包裝。 即使科學家將它分成兩部分，每個包裝在不同的病毒，但會出現其他問題：需要雙重量的病毒來遞送，並且分裂 Cas9 比完整的 SpCas9 活性低。 金黃色葡萄球菌 Cas9 也用於基因編輯。雖然它相對較小（1,053 個氨基酸），適合在 AAV 內，但不能留下足夠的空間用於其他蛋白質。

在這項研究中，團隊發現 CjCas9 既高效又足夠小。 它有 984 個氨基酸，它可以與多個指導 RNA 以及熒光報告蛋白一起包裝在 AAV 中。

為了使用細菌蛋白質進行基因編輯，科學家不得不優化該技術的某些方面。 他們設計了一個短的 DNA 序列，緊接著由 Cas9 靶向該 DNA 序列，稱為前間區序列鄰近基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM）。 每個不同的 Cas9 需要特定的 PAM 序列，否則將不能結合和切割靶 DNA 序列。其次，他們不得不修改嚮導 RNA 的長度。

隨後，IBS 科學家將新的 CRISPR-Cas9 複合體與兩個嚮導 RNA 和熒光報告蛋白一起包裝到 AAV 中，以在小鼠肌肉和眼睛中修改基因。他們集中在涉及年齡相關性黃斑變性（AMD）的兩個基因，因為這兩個基因是成年人失明的主要原因之一。 一個基因是 ADM 的常見治療靶標，稱為血管內皮生長因子 A（VEGF A），另一個基因是激活 VEGF A 轉錄的轉錄因子，被稱為 HIF-1a。 與 VEGF A 不同，HIF-1a 未被認為是藥物靶標。 所謂的「可流產」基因，例如一般的轉錄因子，不能被抗體和其他生物或化學藥物直接靶向。 在這項研究中，研究小組證明 CjCas9 通過 AAV 傳遞到視網膜可以有效地滅活小鼠中的 Hif1a 和 VEGF A，並減少脈絡膜新血管形成（CNV）的面積。

眼內注射 AAV 包裝的 CRISPR-CjCas9 可以有益於治療各種視網膜疾病和全身性疾病。 KIM Jin-Soo 解釋說：CjCas9 是高度特異性的，不會導致基因組中的脫靶突變。

小鼠和人的 Hif1a 基因靶序列是相同的，因此本研究中提出的方法將來可用於治療人類患者的 ADM。 通過鋪平 CjCas9 應用於「不可排除」基因或非編碼序列的方式，這種技術可以拓寬治療靶標的範圍，使得整個人類基因組潛在地可藥物化。

參考資料：

1.In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni

2.The smallest Cas9 genetic scissors (so far)

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