張鋒 CRISPR 基因編輯專利官司獲勝

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張鋒 CRISPR-Cas9基因編輯技術的專利官司今天出結果了。美國專利局法庭（注一）宣布張鋒獲勝。

眾所周知，Doudna在2012年六月發表論文，首次報道運用CRISPR-Cas9在試管中實現DNA片段的切割。6個月後的2013年1月，張鋒的研究小組發表論文，在人類細胞中用CRISPR-Cas9實現基因編輯，並很快申請了專利。2016年3月，Doudna提出專利干擾訴訟，稱張鋒的發明顯然是在她的專利基礎上的事情。據報道，雙方為了專利訴訟花了千萬美元的律師費。

在此之前，我對張鋒的了解僅僅是在韓春雨事件中聽過其名而已，而且似乎有人對他的名氣還存在疑問。在閱讀相關資料后，我發現張鋒才是CRISPR -Cas9技術的集大成者。圍繞雙方的爭議，我寫了若干博文。介紹了CRISPR-Cas9基因編輯技術，也分析了張鋒與DOUDNA在CRISPR-Cas9的專利官司。相關介紹參見：《張峰專利官司科普及案情發展-叛逃者將被UC傳訊》、《CRISPR基因編輯技術及張鋒的貢獻》、《CRISPR基因編輯技術的顯然性分析》、《CRISPR基因編輯研究秘辛大起底》、《發自張鋒實驗室的四封CRISPR郵件》。

在《CRISPR基因編輯技術及張鋒的貢獻》

一文中，我結論到 【張鋒首次將CRISPR-Cas9成功用於高等生物的基因編輯，其主要成果是基於2011年Charpentier的tracrRNA發現】。在2012年初，也就是Doudna論文發表前半年，張鋒就已經提交了完整的真核細胞基因編輯設計。張後來的論文結果基本是基於這個設計。

事件中，張鋒實驗室還出了一個留學生背叛者，向DOUDNA提供內部消息。但這個學生提供的電子郵件等信息恰恰證明張鋒在 2012年初就開始了相關真核細胞的基因編輯研究，並且明顯找到了關鍵。而DOUDNA在其2012年論文發表之後數個月仍未能成功實現真核細胞的基因編輯，直到張鋒合作夥伴CHURCH提供了真核編輯的數據之後才獲得成功。

根據張鋒所在布羅德研究院的聲明，美國專利局法庭在2月15日宣布，Doudna針對張鋒的真核細胞CRISPR-Cas9基因編輯技術的專利干擾訴求不成立。美國專利局判決稱：

➤Doudna與Vilnius的專利申請只是在試管中剪切DNA片段，沒有涉及細胞、基因組，也沒有基因編輯。（The applications filed in 2012 by the Vilnius team and the Berkeley team each showed only that purified Cas9 protein and a certain purified RNA could cut a short piece of DNA in a solution in a test tube. In both cases, the applications in 2012 contained no cells, no genomes, and no editing.）

➤Vilnius的專利申請只是自然系統不能申請專利（專利必須是人腦的創造，自然現象不能申請專利）（The USPTO rejected the Vilnius application as not having significantly more than a study of the natural system and failing to describe invention.）

➤張鋒的真核細胞基因編輯專利不受Doudna專利影響。

對相關技術感興趣的讀者可以參閱《CRISPR基因編輯技術的顯然性分析》等博文。另外，科技時代，科學技術是財富。據報道，去年 Doudna 專利官司啟動后，張鋒的 EDITAS 公司股價從 $42 開始大跌，最低只有13。今天 EDITAS 大漲 30%，達到 $24。張鋒的財富量在10年內可能超過到處搗房地產的美國總統川普家族。

雖然科學研究的目的是為人類文明做貢獻，而不是獲取，但能用科技智慧創造財富也許更能夠激勵人們進行科學探索。

科學網的生物學家們都有希望。加油！

注一：讀者可能問，專利局怎麼有法庭，這個問題我在之前解釋過——這叫administrative law court.

附件：

上所有細胞生物的遺傳信息都儲存在數字化的DNA序列中。今天，基因測序技術已經非常發達，DNA序列可以非常廉價迅速的確定。但測序只是讀取數據，近年生物學最大的發現與發明之一是可編程的基因編輯技術：CRISPR-Cas9。這個技術類似於 WORD的搜索替換功能：用戶輸入一串字元串，程序找到匹配的字元串，然後進行刪除或者替換。CRISPR-Cas9的編輯技術里，搜索匹配字元串由實驗人員通過一段RNA表示，叫做導引RNA——gRNA，編輯由一個稱為Cas9的蛋白根據gRNA定位完成。這個編輯系統的靈活性顯而易見。Cas9蛋白是固定的，你只需要改變導引就能在不同位置對DNA進行編輯（注一）。

CRISPR-Cas9技術的來源是細菌的自然免疫系統。某些細菌在遭到病毒入侵后，能夠把病毒基因的一小段存儲到自身的DNA里一個稱為CRISPR的存儲空間。當再次遇到病毒入侵時，細菌能夠根據存寫的片段識別病毒，將病毒的DNA切斷而使之失效。有的細菌的CRISPR系統很複雜，涉及多種Cas蛋白（Cas的意思是CRISPR-associated——與CRISPR相聯的）。經過多年的研究，生物學家們終於找到了一種簡單的系統，只用到一種蛋白——Cas9。接下來，他們成功地把這個細菌的系統進行改造用於動植物細胞的基因編輯。率先完成這一實際應用性開發的是張鋒的研究小組。本文試圖對相關技術與歷史進行簡單的介紹。

這裡我把CRISPR之前漫長的研究歷史一筆帶過。簡單而言，人們之前發現細菌免疫系統依靠一段很短的RNA進行識別，這段RNA稱為crRNA（CRISPR RNA）。可想而知，這段crRNA包含有入侵病毒的基因識別碼。

CRISPR相關研究在2011年取得了重大突破。這一年，法國女科學家Emmanuelle Charpentier報告，通過基因分析與相關實驗，發現一個只有四個組件的細菌免疫系統。除了Csn1蛋白（後來稱為 Cas9）與crRNA外，還發現一個他們稱之為trans-activating CRISPR RNA（簡稱tracrRNA）的RNA。顧名思義，這個tracrRNA 起到轉寫-啟動的功能。第四個組件是一個作用於RNA的生成，稱為RNase III的蛋白。但這篇2011年的論文對各個組件的具體功能並沒有完全確定。其論文中的下圖顯示：藍色是Cas9蛋白，紅色的是tracrRNA, 綠色+黑色線段是crRNA（其中綠色部分對應需要識別的病毒編碼），黃色是RNase III。

Charpentier 的論文發表后，美國加州大學的 DOUDNA（「道得娜」——有些中文文章音譯成「多德娜」屬於錯誤讀音）與她的研究小組隔洋合作，進行了進一步研究，於2012年6月發表了一篇重要論文。相關研究人員與主要結果如下圖：

DOUDNA、Charpentier 聯合小組通過在細胞體外的試管實驗發現了負責DNA切割的充分並且必要的三個部分：Cas9, crRNA與tracrRNA（不需要RNase III）。論文還確定了三個部分的作用：其中Cas9是切割機，crRNA的主要作用是定位。而tracrRNA在與crRNA耦合后啟動Cas9的切割功能(activate)。他們還成功把 crRNA與tracrRNA 連起來成為一個分子，這樣可以把DNA切割的組件由三個變成兩個。如上圖。左邊是自然原核細菌中的機制，兩個RNA分子。右邊則是人工機制，把兩個RNA給連起來了，成為一個帶著一個配對圈的RNA分子。但DOUDNA等人的實驗並沒有在任何細胞內進行，只是在細胞體外的試管里，當然也沒有在動植物等真核細胞內實驗，也不知道能否可行(「it was not known whether such a bacterial system [the CRISPR-Cas9 system] would function in eukaryotic cells.」）。在該論文發表後幾個月，DOUDNA等人表示在真核細胞的實驗中遇到了很多困擾（"many frustrations"）。

現在我們知道，Charpentier 2011年的論文出來后，美國東部 BROAD研究院的張鋒小組也展開了研究。在Doudna/Charpentier 2012年6月論文發表前半年，張鋒在2012年1月向NIH申請了一個項目：運用Cas9系統對真核細胞進行基因編輯。張鋒的項目設計如下（從其項目申請截圖）：

上圖是一個哺乳動物 CRISPR 基因編輯系統的設計。其代碼進行表達後會生成四個部分：（1）帶NLS的Cas9 蛋白，（2）tracrRNA , （3）多個crRNA——注意不同顏色的線段 (圖中稱為 guide RNA array)，(4) 帶NLS的RNase III。真核細胞的特點是遺傳物質在細胞核內，一般較大的蛋白是進不去的。其中 的NLS是為了使Cas9等生成后能夠被拖入細胞核內。可以這麼說，張鋒的思路是先不管具體機制是什麼，直接在高等生物上進行基因編輯實驗，而且多點編輯同時進行。

張鋒小組的核心人物包括：張鋒、叢樂、FEI RAN

張的小組在2013年1月發表論文，報告了他們的發現：（1）他們對四個組件進行了組合實驗，發現基因編輯不需要 RNase III；（2）使用Cas9 、crRNA與tracrRNA組合，成功對真核細胞實現編輯，效率相當高（indel達19%）；（3）使用DOUDNA論文中的嵌合RNA (chimera)，發現長的那個（chimera A ）編輯效率較雙RNA系統低(最高5.6%, 部分無法探測），短的那個(chimera B)不能編輯（注二）。如下圖：

張鋒首次將 CRISPR-Cas9 成功用於高等生物的基因編輯，其主要成果是基於2011年Charpentier的tracrRNA發現（注三）。