一篇8分的circRNA/環狀RNA做了哪些內容

就像老是後悔20年甚至10年前沒有買房一樣，很多人在lncRNA火了之後立馬著眼於circRNA了，害怕錯失良機。

今天來看一篇8分的circRNA研究吧。

來自於台灣國立成功大學醫學院特聘教授蔡少正課題組，主要從事以下研究：

一、缺氧誘導因子(HIF-1α)調控基因與癌症抗藥性之研究。細胞因為缺氧會產生種種不同的生理反應或病理變化，包括學習記憶、癌症、心血管疾病、生長遲緩、腦部疾病、肺部疾病等。我們利用生物信息學的方法，將基因體中會受缺氧誘導因子調控之基因（包括人類、大鼠、小鼠）找尋出來，並研究其在生理、病理上的功能，尤其著重在癌症抗藥性方面的探討，目前以大腸癌及胰臟癌的抗藥性機製為重點；

二、研究整個基因體的調控及細胞分化、去分化及再分化的機制。表觀基因體調控對細胞之命運影響至巨，甚或造成細胞病變。利用生物信息學、功能性基因體學、系統生物學等尖端方法，對此一現象作深入的研究；

三、探討子宮內膜異位成因之分子機制。本實驗室過去十幾年的研究，在這個領域已有相當傑出的成果，居於世界領先地位，未來將著重在整合性基因功能上的研究，期盼能發展出可以治療該疾病的方法或藥物。

Non-coding effects of circular RNA CCDC66 promote colon cancer growth and me tastasis. Cancer Res. 2017 Mar 1.

本文的第一作者是該課題組博士后蕭貴陽。CircRNA CCDC66是一條非常新的circRNA，由CCDC66基因編碼。課題組發現在息肉及結直腸癌中circCCDC66的表達是調控的，並且與預后狀況呈負相關。體外實驗表明，circCCDC66調控多個病理過程，包括細胞增殖、遷移、侵襲、錨定非依賴性生長。深入研究表明，circCCDC66通過調控多個腫瘤基因來實現上述功能。體內實驗表明，敲減circCCDC66后能抑制腫瘤的增殖、侵襲作用。這表明，circCCDC66在腫瘤進程及轉移過程起著重要的作用。

主要內容：

1、篩分子

課題組建了一套方法，以增加map率。

接著作者篩選了一些親本基因參與調控細胞周期、信號傳導、表觀調控、轉錄調控的circRNAs作為後續研究。而其中CCDC66基因的轉錄生物學功能鮮有報道，所以課題組決定選擇circCCDC66做進一步的研究。

2、驗證

通過結直腸癌細胞株、乳腺癌細胞株、胰腺癌細胞株、宮頸癌細胞株實驗發現，circCCDC66在腫瘤細胞中的表達上調了，這表明在腫瘤發生時circCCDC66表達普遍提升。另外，研究發現線性CCDC66在腫瘤中的表達要低於其對應的癌旁組織。

且證實了缺氧條件能降低線性CCDC66轉錄本的水平，而circCCDC66表達無顯著變化。這說明瘤內的缺氧應激能促進circCCDC66積累循環，並且由於自身的穩定性能加強這種積累作用。

3、臨床相關

首先，發現circCCDC66在癌前息肉組織中表達提升了，且在腫瘤組織中的水平更高。且在不同分期內，其在腫瘤中的水平都是高於癌旁組織。結合生存曲線，發現circCCDC66與不良預后相關。

且通過ROC曲線計算出AUC為0.88，這表明circCCDC66是CRC病人病情檢測和預后的一個非常好的marker。

4、功能驗證

研究組設計了特定的反向剪接點的siRNA，特異性敲減circCCDC66（對線性的CCDC66 mRNA無影響）后，腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲能力明顯降低。

過表達circCCDC66能增加細胞的克隆形成，BrdU核素摻入法表明circCCDC66能刺激DNA合成。

circRNA和mRNA及lncRNA類似，均有吸附miRNA的功能。作者通過預測，發現有99個miRNAs與circCCDC66有結合位點，這暗示著在結直腸癌中circCCDC66可能保護著一些癌基因免受miRNAs的干擾。同時結合GEO資料庫中3組數據顯示，這99個miRNAs中有66個在結直腸癌中表達。

作者通過分析結直腸癌中有顯著差異表達的癌基因及腫瘤抑制基因，結果發現有37.5%的腫瘤基因與circCCDC66相關miRNAs存在結合位點，而僅有23.5%的腫瘤抑制基因與circCCDC66相關miRNAs存在結合位點。

進一步實驗表明，DNMT3B、EZH2、MYC、YAP1這些與預測miRNAs存在結合位點的蛋白，在circCCDC66過表達時其丰度顯著上調了。而其中EFNA4、FGF9這兩個與預測miRNAs無結合位點的分子，則不受circCCDC66表達變化的影響。

接著驗證circCCDC66的miRNA sponge作用。將帶有生物素的線性RNA環化，用環化后的RNA去pulldown miRNAs。結果顯示，miR-33b、miR-93、miR-185三條被預測與circCCDC66存在結合作用的miRNAs被帶有生物素的circCCDC66富集下來。另外，實驗表明在過表達circCCDC66時，MYC（circCCDC66上調蛋白）其3'-UTR區活性增強（miRNAs吸附減少）。敲減circCCDC66后發現MYC mRNA表達顯著減低。Rescue實驗（加入miR-33b、miR-93抑製劑）后則能回復MYC mRNA水平。這些結果均表明circCCDC66能作為miRNA的海綿，調控MYC表達。

5、體內實驗

體內實驗表明，circCCDC66敲減后腫瘤在體內的生長水平受到了抑制。

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