PNAS：揭示T細胞精疲力竭的分子機制

我們存活到成年的一個原因在於細胞毒性T細胞通常識別和清除癌變的或被病原體感染的細胞。但是招募到腫瘤或感染位點中的T細胞長期過於活躍會使得它們不能夠清除入侵者，即T細胞進入一種被稱作「精疲力竭（exhaustion，也譯作功能衰竭）」的細胞狀態。幸運的是，癌症研究人員正在開發有效的免疫療法抵抗T細胞精疲力竭（T cell exhaustion）和重新激發它們根除病人體內的腫瘤。

為了提高這些免疫療法的療效，來自美國拉荷亞過敏症與免疫學研究所的Anjana Rao博士和Patrick Hogan博士想要知道當T細胞精疲力竭時，哪些基因會被激活。他們的一項新的研究首次報道了精疲力竭的T細胞與正常的T細胞在DNA結構上存在差異。這一發現導致他們編製出一個更新的候選DNA結合蛋白列表，在這個列表中的候選DNA結合蛋白可能啟動T細胞中的精疲力竭程序。這項研究給科學家們提供額外的因子，而靶向這些因子可能是下一代免疫療法的一部分。相關研究結果於2017年3月9日在線發表在PNAS期刊上，論文標題為「Exhaustion-associated regulatory regions in CD8+ tumor-infiltrating T cells」。

Hogan說，「免疫療法在病人體內顯示出真實的療效，但是在一些情形下，這種療效是短期的。為了繼續在臨床實踐中取得真正的進步，我們必須持續地優化這些方法。我們做到這一點的一種方法是理解腫瘤如何誘導T細胞不發揮它們的功能。」

為了觀察T細胞在腫瘤微環境中失去它們的動力，Rao、Hogan及其研究團隊製備出兩種接受基因改造的T細胞群體：測試組中的T細胞能夠識別一種腫瘤抗原，因而在長期接觸這種腫瘤后能夠變成非功能性的；對照組中的T細胞不能夠識別任何腫瘤抗原，因而保持功能性。這就便於他們確定相比於完全功能性的T細胞，在精疲力竭的T細胞內部，是什麼發生偏差。

為此，他們將這些T細胞注射到黑色素瘤負荷模式小鼠體內以便監控測試組和對照組中的T細胞在真實的腫瘤中如何表現。這兩個T細胞群體在腫瘤中聚集，但是隨著時間的推移，正如期待中的那樣，測試組中的T細胞開始表現出高水平的「精疲力竭標誌物（exhaustion marker）」，這是因為它們被這種腫瘤抗原過度激活。這些精疲力竭標誌物之一是PD-1，即一種因阻斷T細胞的細胞殺傷能力而被人所知的蛋白分子（比如，兩年前因證實PD-1抑製劑有效地抵抗一些轉移性黑色素瘤，它們成為頭條新聞）。相比之下，從腫瘤中獲得的對照組T細胞表現出更低水平的精疲力竭標誌物，這僅是因為它們並不感知這種腫瘤的存在。下一步就是鑒定出哪些基因在測試組T細胞中開啟，並且確定這是如何發生的。

為了做到這一點，這個研究團隊將RNA測序和ATAC測序結合在一起。RNA測序可用於鑒定哪些基因開啟，而ATAC測序用於鑒定比基因組其他區域更加鬆散的DNA螺旋。發現這些區域給分子遺傳學家們提供關於細胞中發生什麼的重要線索，這是因為非壓縮的DNA通常含有正在進行活躍表達的基因，並且結合激活這些基因的因子。

ATAC測序揭示出在精疲力竭的T細胞中，它們的基因組含有將近2000個新的「易接近（accessible）」區域，通過減去激活的對照組T細胞中的類似區域，測試組T細胞的易接近區域數量下降到450個。這個研究團隊隨後研究了「精疲力竭相關（exhaustion-related）」DNA片段中的序列，並且利用生物信息學分析，推斷出哪些細胞蛋白可能被招募到這些位點上，從而激活精疲力竭特異性的基因表達程序。

這一分析揭示出很多熟悉的DNA結合蛋白在DNA上的結合位點或者說足跡。其中的一種DNA結合蛋白是NFAT。Hogan說，「這些區域與我們之前在長期接觸病毒感染細胞的T細胞中作為NFAT結合位點繪製出的區域相重疊。這可能意味著在癌症和慢性感染中，相同的通路指導T細胞進入精疲力竭狀態。」

然而，這一分析也提出一些猜測。比如，之前已發現Nr4a蛋白家族與T細胞精疲力竭很少存在關聯。進一步的分析強烈地提示著Nr4a蛋白僅僅促進T細胞精疲力竭，相比之下，NFAT在T細胞中發揮著一種複雜的依賴於環境的作用。明確的結論是NFAT和Nr4a蛋白等DNA結合因子很可能一起促進T細胞功能障礙。

論文第一作者、Hogan實驗室博士后研究員Giuliana Mognol博士說，事實在於Nr4a蛋白似乎僅在T細胞精疲力竭中發揮功能是一個至關重要的發現。Mognol,說，「作為免疫療法，PD-1抑製劑產生良好的結果。即便如此，50%以上的病人並不對這種療法作出反應。鑒定出可能與PD-1一起加以靶向的新分子可能在未來的組合免疫療法中發揮著重要的作用。」

下一代免疫療法的一個目標可能是通過逆轉精疲力竭的T細胞中觀察到的基因組變化來恢復持久的免疫反應。這種逆轉可能是通過讓T細胞受損時鬆散的DNA重新壓縮加以實現。這是否是可行的仍然沒有得到解決。比如，這項研究報道黑色素瘤模式小鼠體內的腫瘤經PD-1抑製劑治療後會縮小，這是因為經治療后，它們的T細胞功能得到改善，而且它們的T細胞在DNA構象上僅發生微小的變化。

Hogan說，「我們在實驗中觀察到T細胞中的細胞信號轉導發生變化，但是不能像逆轉T細胞基因組的結構變化那樣，逆轉這些細胞信號轉導變化。但是我們不會對此感到悲觀，也不想說逆轉這些細胞信號轉導變化是不可能的。鑒於我們確定了其中的一些細胞信號轉導變化，我們的下一個任務是開發逆轉它們的方法。」

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