綜述：CAR-T 治療白血病的前世今生

嵌合抗原受體 T 細胞（CARTs）能夠克服其他免疫治療存在的諸多限制，近年來在血液腫瘤治療方面的進展有目共睹。美國賓夕法尼亞大學血液腫瘤科 Orlowski 教授等在 British Journal Of Haematology 發表了一篇綜述，對當前急性及慢性白血病患者的臨床試驗數據進行了梳理，並探討了可能進一步提高 CART 治療效果及安全性的一些方法。讓我們一起來學習下吧。

靶向 CD19 的 CARTs

CD19 作為常見的靶點之一，在急性淋巴細胞白血病（ALL）、慢性髓系白血病（CLL）、非霍奇金淋巴瘤（NHL）等 B 細胞系的腫瘤中持續表達，且可能與多發性骨髓瘤（MM）的病理進程有關。此外，該抗原僅在 B 細胞表達，因此在殺傷相應腫瘤細胞的同時，不產生非血液學的毒性作用。

• CLL

CLL 是成人最常見的慢性白血病，異基因造血幹細胞移植（allo-SCT）是其有效治療方案，但眾多複發/難治性患者因年齡、合併症、缺乏合適供者等原因未能進行。

CLL 是第一個見證二代 CARTs 潛力的疾病， Memorial Sloan Kettering 癌症中心（MSKCC）將包含靶向 CD19 的單鏈可變區及 CD28 共刺激區的 CARTs 在 8 例化療耐葯的 CLL 患者中應用，結果表明這些 T 細胞能夠進入所有的白血病微環境並持續數周，包括血液、骨髓、淋巴結及相應器官。

包含靶向 CD19 的單鏈可變區及 4-1BB 共刺激區的 CARTs 初始療效也讓人非常振奮，美國賓夕法尼亞大學（PENN）的 3 例患者中有 2 例經治療達到完全緩解（CR），另 1 例患者達明顯部分緩解（PR）。這些結果標誌著 CARTs 在體內大規模擴增，並長時間維持功能，進入並殺傷腫瘤灶。

該臨床試驗的進一步研究納入 14 例患者，總緩解率（ORR）57%，達 CR 的患者最小殘留病（MRD）陰性，超過 4 年的隨訪中無複發。初次輸注 CARTs 后 3 年，可通過外周血流式細胞術及聚合酶鏈式反應檢測到 CARTs ，細胞因子的產生及體外對 CD19 抗原的反應表明其功能可長時間維持。

美國國家癌症研究所（NCI）採用 19-CD28ζ CARTs 治療 CLL 結果也顯示非常有效，3/4 的患者達持續 CR。

以上數據表明了 CARTs 在複發/難治性 CLL 中的療效及達 CR 明顯的持久性。

• ALL

靶向 CD19 的 CARTs 治療複發/難治性 ALL 取得了空前的成功，緩解率達 70-93%。

PENN 及費城兒童醫院（CHOP）的數據顯示，30例複發/難治性ALL患者輸注CART 1個月後CRR 90%。CART 在 68% 患者體內持續作用，無病生存率 67%，第 6 個月時的 OS 為 78%，19 例患者在 24 月時仍無病生存，其中 15 例患者未接受進一步治療，僅 3 例患者行 allo-SCT。與 PENN 開展的 CLL 患者的臨床試驗相似，CARTs 擴增的失敗與缺乏治療反應相關。

Fred Hutchinson 癌症研究中心進行的一項研究採用 19-4-1BBζ CART 治療複發/難治性 ALL 患者，30 例患者淋巴細胞減少后採用環磷醯胺（Cy）合用或不合用氟達拉濱（Flu）治療。其他研究也反映了這一方案的有效性，所有患者均達骨髓形態學CR，86% 的患者 MRD 陰性，7/8 僅接受 Cy 治療的患者複發，6 例出現 CD19 陽性原始細胞及 CARTs 的丟失，接受 Cy/Flu治療的患者僅 1/17 複發。

MSKCC 採用 19-CD28ζ CART 治療的研究緩解率更高。16 例複發/難治性 ALL 患者採用補救性化療后 Cy 治療以減少淋巴細胞，88% 的患者達 CR，絕大多數 MR 陰性，10 例患者中 7 例行 allo-SCT，隨訪至 24 月，未見複發；未行 allo-SCT 的患者，CARTs 持續時間達 3 個月。

NCI 同樣在 Cy/Flu 處理后，採用 19-CD28ζ CART 治療 20 例 ALL 及 1 例 NHL 患者， 70% 的 B 細胞系 ALL 患者達 CR，60% MRD 陰性，10 例患者行 allo-SCT，9.7 個月時的 O S為 51.6%，CART 持續時間 68 個月。

以上數據表明了 CART19 治療 ALL 的顯著療效。雖然仍存在複發，但多數患者能在未行後續 allo-SCT 的情況下持續緩解。因此，CART 治療可能成為複發/難治性ALL患者最有效的治療方案之一。是否 CART 治療能早期應用於此類患者及其與 allo-SCT的治療之間如何協調有待確定，且將成為以後臨床試驗的主題。

CART19 相關毒性

• 細胞因子風暴

細胞因子釋放綜合征（CRS）是一種因細胞因子的顯著升高引起的系統性炎症反應，同時伴有 CARTs 的迅速體內活化及增殖，通常在首次輸注后數天內發生。其初始的標誌性臨床表現：發熱、流感樣癥狀，可迅速進展為血管擴張性休克、毛細血管滲漏及呼吸功能損傷等重度 CRS （sCRS）的表現。多數 CARTs 治療的患者均會出現 CRS，27%~64% 的患者出現 sCRS。

33g/L，C 反應蛋白（CRP）升高，纖維蛋白原降低，IL6、IFN-γ、sIL2Rα 等細胞因子也有顯著升高。

眾多研究致力於尋找能夠預測 sCRS 進展的標誌物，儘管結果各不相同，但越來越多的證據表明：輸注細胞的量、腫瘤負荷、淋巴細胞縮減的治療方案、CART 增殖高峰的增高均對 CRS 的產生有重要作用。

有研究表明，IL6 受體拮抗劑妥珠單抗可迅速改善 CRS 癥狀，較類固醇毒性有限，是治療 CRS 較好的選擇。

• 神經毒性

神經毒性包括譫妄、腦病及抽搐，由系統性、大量的炎症因子穿過血腦屏障或直接在中樞神經系統產生引起。儘管 FHCC 的研究表明，血清 IL6 第一天的濃度 ≥30 pg/ml 可能提示嚴重的神經毒性，但這些臨床癥狀的產生與系統性 CRS 似乎並無明確關係，對抗 IL6 受體治療也無明顯反應。

• B 細胞發育不全

B 細胞發育不全及低丙種球蛋白血症是有功能 CART 持續存在的生物學標誌，持續性的 B 細胞發育不全最大的風險是機會性感染，可通過免疫球蛋白輸注緩解。CART 19 治療后持續性 B 細胞發育不全患者的長期結果還不知曉，嚴重感染目前為止也無明顯上升。

AML 中 CARTs 的應用

CARTs 應用於 AML 的臨床研究目前雖不及 CLL 和 ALL，但未來仍有巨大的發展潛力。當前，AML 的 CART 治療最大障礙是確定合適的抗原靶位，以下幾個靶位臨床試驗探索較多：

• CD123

CD123 在造血細胞持續性表達，白血病細胞中表達上調，但靶向 CD123 的 CARTs 細胞可能會導致不可逆的骨髓細胞清除。此外，CD123 在包括內皮細胞在內的非血液組織也有表達，可能引起其他毒性。

• CD33

CD33 在白血病細胞中異質性表達，約 75% 的患者有 CD33 陽性的腫瘤細胞，CD33 剪接體變異影響其蛋白結構，因此當前靶向 CD33 的治療方案可能無效。正常的骨髓細胞及其他組織如肝臟中的巨噬細胞也表達 CD33，因此對這些組織也可能有毒性。有臨床前研究證明抗 CD33 CART 在抗白血病的同時引起了明顯的骨髓毒性。

• lewis Y抗原

lewis Y 抗原（LeY）是一種與 Lewis 血型抗原相關的寡糖結構，在其他組織表達極少，在多種包括 AML 在內的腫瘤中均有表達。

一項逆轉錄病毒誘導的 LeY-CD28ζ CART 治療 AML 患者的研究結果顯示：3 例細胞 MRD 陽性的患者中，2 例治療后仍為 MRD 陽性，僅 1 例轉陰，但在治療 5 個月內複發，1 例形態學陽性的患者外周血腫瘤細胞一過性減少。其抗腫瘤治療失敗的原因不明。

• 葉酸受體β

AML 腫瘤細胞中葉酸受體β（FRβ）上調，應用 4-1BBζ CARTs 進行的臨床前研究顯示出強大的殺傷白血病能力，但保留了正常的 CD34 陽性細胞。同時，研究人員採用全反式維甲酸（ATRA）上調靶抗原，提高了其殺傷腫瘤細胞的能力。通過上調抗原提高藥物殺傷能力的方法值得探索。

構建更好的 CART

• 優化 CARTs 構建的起始原料

CD4/CD8 陽性 T 細胞的絕對數、表型【幼稚T細胞（TN）、中央記憶型T細胞（TCM）或效應T細胞（TEM/EMRA）】、先前治療方案的毒副作用等在不同患者間各不相同，對產生高質量的 CARTs 有顯著影響。有研究表明 TN 、 SCM 及 TCM 較TEM/EMRA 構建的 CARTs 抗腫瘤效應更強，增加這類細胞群的方法包括：提前分選、加入 IL7、IL15 及 IL21 共培養等。

T 細胞對刺激的增殖能力在各種疾病間各不相同，CLL 患者的 T 細胞通常很難擴增，並且活性較 ALL 稍差。產生這些差異的原因不明，以下解釋供參考：CLL 常見的治療方案可能對T細胞有長期的負面影響，或 CLL 患者的 T 細胞因暴露於高抗原負載及免疫抑制因子而幾近衰竭。

此外，也可採用供者來源的健康 T 細胞構建「現成的CARTs」,該方法的問題在於 MHC 很難匹配，當前通過轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALENT）及規律成簇間隔短迴文重複序列（CRISPR）等基因編輯技術，可有效的移除 MHC 分子，T 細胞受體（TCRs）、CD 抗原及其他供者 T 細胞的蛋白，避免同種異體反應。

未來將有更多臨床試驗評估這些方案的有效性，CART 的構建及應用可能產生巨大的進步。

• 不同 CART19 構建的經驗

有研究表明含有 4-1BB 區的 CARTs 能夠維持功能長達幾年時間，而 CD28 CARTs 僅能維持數月，可能是通過 scFvs、共刺激區、胞內信號、細胞代謝的相互作用。CART 殺傷能力的下降與增值能力差、細胞因子產生減少、抑制性受體的增加及轉錄模式的改變及細胞調網概率的增加有關。

早期 T 細胞內代謝紊亂也能作為 T 細胞衰竭的啟動因素，胞內共刺激區可能在不同程度上改善這一現象。總之，加上共刺激區的 CARTs 可能是模仿自然免疫反應最理想的工具。

• 防止 CD19 陰性患者的複發

白血病細胞 CD19 的丟失是由於可變性剪接破壞了其抗原表位，採用包含多種抗原的T細胞做成「CART雞尾酒」，或可減少腫瘤逃逸。有研究採用抗 CD19 和 CD123 治療 B 細胞性 ALL，構建了一個能夠表達多種 CARs 的 T 細胞或一個雙特異性的CAR，從而達到減少腫瘤免疫逃逸的目的。

• 提高 CARTs 安全性

構建需要多抗原或附加信號激活的 CART 能夠提高區分腫瘤和正常組織的能力，從而減少毒副作用，增加這些抗原可能對 AML患者效果較好。

• 艱難前行：CART 的免疫障礙

調節T細胞、抑制性細胞因子、化學介質及免疫檢查點抑製劑有 T 細胞毒性。

PD-1/PD-L1 在眾多血液腫瘤的治療中至關重要，CART 很可能像調節性 T 細胞一樣被 PD-L1 表達所制，PD-1 抑製劑可能打破這種相互作用，導致 CART 毒性的增加。採用基因編輯工具干擾 PD-1在T細胞表面的表達，從而干擾抑制性信號通路，可能不失為一種有效方法。

此外，將 PD-1 受體和 AR 結構結合，以啟動 PD-L1 在 TEMs 的表達，進一步增加 CART 細胞因子的分泌、增殖及相關酶的表達，也能更好的控制腫瘤。