RNA修飾成學界熱點技術難關仍待突破

我們並不清楚一個分子上有多少不同的修飾。但有一點很清楚，這個領域非常有意思，值得繼續深究下去。

這是一個與mRNA結合的細菌核糖體的分子模式圖。

圖片來源：Laguna Design

今天，表觀轉錄組學研究正在蓬勃開展，不過相關的技術仍不夠完善，還需要繼續開發。例如，目前技術的靈敏性尚有不足，無法對少量稀有樣本開展研究，無法對轉錄組修飾開展定量研究，並且無法通過一次試驗發現多種不同的修飾等。而技術上的問題早在多年前就一直困擾著研究人員。

2004年，以色列特拉維夫大學腫瘤學家 Gideon Rechavi和同事將當時能找到的所有人類基因組DNA 序列與對應的信使RNA（mRNA）進行了比對，希望找到mRNA序列里的腺嘌呤轉換成次黃嘌呤的信號。

這種轉換會改變蛋白質的編碼序列，對人類而言，這是保證天然免疫系統正常功能的關鍵因素。Rechavi回憶道：「這項工作聽起來簡單，但實際上非常複雜。多個研究小組都曾嘗試過，但都以失敗告終。」主要因為當時的測序技術還不發達，會產生很多錯誤的測序結果，進而帶來很大數據雜訊。

但Rechavi等人使用了新的生物信息學工具，所以成功地在轉錄組中發現了數千個轉換位點—— 一個有機體或細胞群中的所有mRNA，後續的研究又陸續將這些轉換位點的數量增加到了數百萬個。

不過，次黃嘌呤轉換算得上是一種特例：科研人員只需將DNA序列與RNA序列進行比對就能發現這些位點。但在mRNA序列里，至少有1/4 的核酸（A、C、G、U）是攜帶化學修飾物的（表觀遺傳學修飾），而現有的測序方法無法發現這些修飾物，科研人員也不知道這些修飾物會給RNA帶來何種改變。

近年來，學界掀起了一股研究RNA表觀遺傳學修飾的熱潮，很多課題組都將目光集中在 N6—甲基腺苷（m6A）這個核酸分子上，研究在全轉錄組水平上的這種化學修飾，以及該修飾與人體健康和疾病的關係。但該研究面臨的問題非常大，因為這種修飾不僅發生在mRNA分子上，也發生在其他RNA 分子上，幾乎涉及生命科學的所有領域，連病毒的RNA都會發生這種修飾。

其實這些修飾本身並不新奇。人們之所以如此關注這種修飾，是因為發現了與這些修飾有關的酶，並且對其有了一定的認識和理解。2010 年，美國芝加哥大學化學家何川提出，這種化學修飾反應是可逆的，而且對於基因表達調控具有非常重要的作用和意義。

不久之後，何川課題組發現了mRNA化學修飾去除酶——FTO。該發現意味著m6A不只是一個被動的修飾物，細胞也可以逆轉這種修飾反應，即mRNA的化學修飾是可以由細胞來操控的。

用抗體繪圖

早在上世紀70年代初，科學家就發現mRNA存在化學修飾現象，當時使用的技術是對m6A進行放射性標記。但因為這些實驗都是通過mRNA 3』端多聚腺嘌呤尾高選擇性技術富集mRNA分子，所以科研人員擔心這會摻雜進其他種類的RNA。

美國威爾·康奈爾醫學院化學生物學家 Samie Jaffrey表示，「正是因為這個原因，讓他們無法確定mRNA里是否還存在其他RNA以及是否發生了『污染』，人們最終放棄了這種方案。」

另一個難題是確定mRNA里哪些位點發生了m6A修飾。傳統測序技術會用到逆轉錄反應，即將RNA逆轉錄成互補DNA（cDNA），然後再對cDNA 進行擴增及測序。可是這些逆轉錄酶會去除mRNA上的修飾物。對此，Jaffrey 指出，所以人們根本看不到m6A。

不過雖然存在這些技術上的障礙，科學家還是在細菌的RNA上發現了一些修飾現象，這也引起了Jaffrey 的興趣，她決定看看在哺乳動物的RNA里是否也存在這種修飾。

她和同事、遺傳學家Chris Mason一起，首先將RNA分子切成小片段，然後用含有特異性針對m6A的抗體對這些片段進行洗脫，最後對富集后含有m6A修飾物的RNA分子測序。通過這種方法，她們清楚地看到了mRNA上的修飾物，而且完全沒有污染。Rechavi課題組也通過類似方法發現了大量的m6A修飾位點。目前，這些名為m6A-seq和MeRIP-seq的研究方法已經被人們廣泛採用。

多種修飾

其他RNA 化學修飾也引起了科研人員的注意。2016 年，由北京大學化學家伊成器、Rechavi與何川共同領導的兩個課題小組使用新抗體技術，實現了全轉錄組水平上N1—甲基腺苷（m1A）這一可逆RNA修飾的譜圖鑑定，發現m1A修飾能夠促進蛋白質的翻譯過程。

雖然研究人員尚不清楚m1A的具體作用，但已經找到了一條線索，即絕大多數RNA都只含有一個m1A位點，而且這些被修飾過的位點的翻譯頻率要遠遠高於其他未修飾的位點。Rechavi說：「這讓我們非常興奮，當然也是一個挑戰，因為我們即將面對的是一套全新的mRNA翻譯調控機制。」

而其他全轉錄組化學修飾研究策略，主要利用的就是某些RNA修飾物能夠與化學標籤結合的特性。當伊成器在2011年末建立自己的實驗室時，人們已經非常清楚，在其他RNA里含有很多修飾過的RNA組成的核酸——假尿嘧啶，但在mRNA里還沒有發現過這些核苷。

2015 年，伊成器實驗室發現了一種化學標記和洗脫方法，可用於富集mRNA上的化學修飾物。出乎預料的是，他們在人和小鼠的mRNA中發現了大量假尿嘧啶。於是他們開始專註於研究這些化學修飾物的功能。

伊成器認為，「mRNA里的假尿嘧啶可能具有多重功能，這取決於它們在什麼時候、什麼位置、如何出現，以及是如何對RNA進行調控的。」目前人們也發現了很多假尿嘧啶寫入因子，但還不清楚是否存在假尿嘧啶擦除因子和識別因子。

不論是抗體還是化學標記，發現RNA中化學修飾位置都是一項非常麻煩的工作。例如，使用抗體時會面臨交叉反應的問題，因此，科研人員必須使用兩種以上的抗體進行實驗，而且還得進行交叉驗證。而使用化學標記方法又有可能更傾向於切斷、結合和富集某些特定的RNA片段並帶來偏倚。

伊成器表示，測序深度和所使用的生物信息學軟體會影響人們發現RNA修飾位點的工作。此外，細胞培養時間也會影響RNA的修飾水平。

優化工具

但無論何時，僅知道某個化學修飾是遠遠不夠的。芝加哥大學分子生物學家Tao Pan 指出，人們還需要對所有的RNA修飾進行定量分析，因為細胞也許就是依靠一定量的RNA修飾才能進行某種功能。對於那些希望通過激活RNA修飾相關蛋白調控修飾水平的科研人員而言，這種修飾定量信息尤為重要。

2015 年，Pan課題組提出了RNA修飾定量研究策略，至少可用於轉錄RNA（tRNA）的修飾研究。該策略採用了一種特殊的逆轉錄酶，能以較高的效率通讀待測RNA分子，哪怕分子中有很多位點已經發生了化學修飾，也不影響該逆轉錄酶的效率。

但最快速了解這些化學修飾物功能的方法可能就是發現它們的識別因子、寫入因子和擦除因子。一旦人們發現了能夠識別某種化學修飾物的因子，那麼就可以很容易地通過基因編輯技術調控該因子的表達，從而幫助科學家在全局上發現化學修飾改變的跡象。

近幾年，何川課題組又發現RNA修飾是一種轉錄子調控機制，參與了細胞內多種不同的作用。因此，科學家迫切需要更多、更好的新技術來探索這些奧秘。

去年10 月，美國國立衛生研究院給何川和Pan提供了一個為期5年、總金額為1060萬美元的資助，以幫助他們建立一個新中心，用於開發與RNA修飾研究有關的新技術。

藉助新影像學技術，人們有可能在肉眼下看到某個RNA分子上的修飾物。此外，科學家開發出新的RNA直接測序技術，以替代傳統測序方法。比如英國牛津納米孔技術公司成功將DNA納米孔測序技術拓展成RNA納米孔測序技術。

但目前仍存在其他挑戰，例如在數據方面就有不小的困難，比如RNA修飾的絕對數量就是個問題。在一個RNA分子上找出所有的修飾，這需要對軟體進行大量嚴格的訓練，才能夠讓它們準確地識別並區分每一個修飾位點的具體情況。約翰斯·霍普金斯大學生物醫學工程師Winston Timp 說：「我們並不清楚一個分子上有多少不同的修飾。但有一點很清楚，這個領域非常有意思，值得繼續深究下去。」（張章編譯）