宋保亮組發現新型膽固醇共價修飾蛋白丨BioArt特別推薦

BioArt按：長久以來hedgehog被認為是唯一被膽固醇修飾的蛋白，然而生命科學領域中的所謂「唯一」通常是用來被打破的。3月23日，Molecular Cell在線發表了來自武漢大學生命科學學院宋保亮教授團隊與華東師範大學仇文衛副教授課題組合作完成的題為「Cholesterol modification of Smoothened is required for hedgehogsignaling」的研究論文，該研究發現了一個新的膽固醇修飾蛋白Smoothened (SMO)並闡明了該修飾的調控機制，這是時隔20年後發現的又一膽固醇共價修飾蛋白，顛覆了長久以來認為hedgehog是唯一被膽固醇修飾蛋白的認識。此外，值得一提的是，該研究不僅在細胞水平證明了膽固醇修飾對SMO的功能的必須性，並且在小鼠水平證明了膽固醇修飾在體內的作用。

論文解讀：

Hedgehog信號通路是調節動物胚胎發育的經典信號通路之一，Hedgehog(HH) 基因是1980年由 Nusslein-Vollhard 和Wieschaus 在研究果蠅的突變體時發現 ，該基因突變會導致果蠅幼蟲體表出現許多刺突，形似刺蝟，故命名為 Hedgehog（下圖）。

Hedgehog信號通路主要由信號分子Hedgehog（HH）、膜受體PTC、SM以及轉錄因子GLI2/3構成（下圖）。隨著近年來有關Hedgehog信號通路的深入研究，人們對其在腫瘤發生髮展中的作用有了新的認識，並有望成為腫瘤治療新的靶點。

圖片引自：van den Brink, G. R. (2007). Hedgehog signaling in development and homeostasis of the gastrointestinal tract. Physiological reviews, 87(4), 1343-1375.

1992年有3個課題組分別獨立報道了果蠅中的Hedgehog（hh）基因編碼一種分泌蛋白，其中約翰霍普金斯大學Philip Beachy課題組在Cell發表了相關文章（下圖）。

1996年，Philip Beachy課題組在Science發表文章報道了第一個也是20年中唯一一個膽固醇修飾蛋白，Hedgehog（下圖）。

20年以來，雖然關於新的膽固醇修飾蛋白的猜想一直都有，但從來沒有新的膽固醇修飾蛋白被報道。相對於經典的翻譯后修飾，膽固醇修飾作為一種特殊的修飾一直沒有很好的鑒定方法。針對這一熱點領域，宋保亮研究團隊和華東師範大學仇文衛實驗室合作，合成了一種新的膽固醇探針，利用此探針建立了一套以點擊化學反應和化學生物學為基礎的新篩選方法（下圖）。

結合大規模質譜鑒定，研究人員驚喜的發現，Hedgehog通路的重要下游信號轉導蛋白SMO可以被膽固醇修飾。研究人員進一步利用質譜手段確認了SMO的膽固醇修飾，並鑒定到SMO的修飾位點在其N端的Asp95(D95)位，相應的生化試驗也驗證了這一點，SMO(D95N) 點突變可以完全阻止SMO的膽固醇修飾（下圖）。

熟悉Hedgehog信號通路的人們可能知道，成熟Hedgehog蛋白可以結合其受體Patched（PTC），並釋放PTC對SMO的抑制作用，SMO轉運到纖毛上，從而激活下游的Gli轉錄因子，促進Hh靶基因的表達。但是，Hh和Patched在機制上是如何調控SMO活性的？這是Hh pathway 領域裡的一大核心問題。宋保亮研究組發現，Hh可以促進SMO的膽固醇修飾，而Patched可以抑制其膽固醇修飾，從而證明了Hh是通過解除Patched對SMO的膽固醇修飾抑制來調控其活性的（下圖）。該發現解決了長久以來困擾hedgehog 領域的一大難題。

膽固醇修飾SMO對其功能影響示意圖

膽固醇修飾對Hh的運輸及功能都有重要作用，那麼SMO的膽固醇修飾有什麼作用呢？為了回答這一問題，宋保亮研究組對SMO(WT)和SMO(D95N)進行了詳細的分析，發現膽固醇修飾對SMO向纖毛上的轉運是必須的。結合Gli熒光素酶實驗，證明膽固醇修飾對其轉導Hh信號也是必不可少的（下圖）。

膽固醇修飾位點突變后，Smoothened（SMO）向纖毛的轉運被完全阻止

為了進一步在體內研究膽固醇修飾對SMO功能的影響，該研究組構建了SMO-D99N（對應人源SMO中的D95N）的Knock-In小鼠。發現純合的SmoD99N/D99N小鼠會造成胚胎致死（下圖）。病理學研究表明，純合SmoD99N/D99N小鼠出現了嚴重的胚胎和心臟發育障礙。並且小鼠的神經管中Hh下游基因的表達也顯著降低。進一步的定量PCR進一步確認了Hh pathway下游基因表達的抑制。

純合膽固醇修飾位點突變小鼠發育障礙並胚胎致死

以上研究證明，膽固醇修飾對SMO的活化有重要意義，提示SMO的膽固醇修飾可以作為一個治療Hh相關癌症的新靶點。

值得一提的是，宋老師實驗室是以研究膽固醇為主的脂類代謝實驗室，在膽固醇代謝領域發表了多篇高水平論文（詳見文末宋老師簡介）。本課題是宋老師實驗室拓展的一個新方向，跨界到Hh pathway領域，給人一種全新的感覺。

本研究的重要意義包括：1、發現了一種新的膽固醇修飾蛋白SMO，並鑒定了其修飾位點；2、證明Hh和patched可以通過調控SMO的膽固醇修飾來控制SMO的活性；3、通過Knock-In小鼠證明了膽固醇修飾在胚胎發育過程中的重要作用；4、本研究的結論提示SMO的膽固醇修飾提供了一個新的治療Hh pathway 相關癌症的策略。

據悉，宋保亮課題組的學生肖旭和唐靜潔博士為該論文的共同第一作者，宋保亮教授和華東師範大學化學與分子工程學院仇文衛副教授為共同通訊作者。本研究中所用到的各種新型探針都是由華東師範大學仇文衛教授課題組設計併合成的。本項研究工作還得到了許多課題組的支持。質譜數據由國家蛋白質中心黃超蘭研究員課題組的彭超博士等完成，SMO功能分析實驗得到了生化細胞所趙允研究員的大力支持。另外，研究過程中，也得到了生化細胞所李伯良研究員、周斌研究員、武漢大學殷雷教授、羅婕博士和韓強強博士等的支持和幫助。該工作得到了國家科技部和國家自然科學基金的支持。

後記：鑒於宋保亮老師這個工作的重要開創性意義，筆者藉此機會就多說幾句。筆者在與裴華東老師（北京蛋白質組研究中心研究員，青年千人）就這個工作交流的過程中，裴老師毫不掩飾的盛讚了這項工作，並評價這項研究應該是宋老師近年來最具代表性的工作之一。這項研究對於膽固醇這種新的蛋白質翻譯后修飾來說是打開了一扇窗戶，是開創性，會引領不少後續的相關研究。例如，可以從蛋白組學水平鑒定更多具有這種修飾的蛋白、發現可以識別這種修飾的reader、這種修飾是如何被精細調控以及相關的生物學功能研究等等。這項研究還告訴我們，生物學家和化學家合作的重要性，方法學在生命科學研究中的重要作用不容忽視，因為開創性的東西往往要比那些系統性的常規篩選要複雜的多，沒有多少可以借鑒的例子。希望宋老師團隊再接再厲，繼續推動膽固醇修飾領域向前發展！

致謝：感謝蔣威博士對本文的貢獻！

宋保亮，現任武漢大學生命科學學院教授、院長，國家「傑青」和長江學者特聘教授，萬人計劃科技創新領軍人才入選者，國家重大科學研究計劃首席科學家。1997畢業於南京大學生物科學與技術系，隨後進入中科院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所攻讀博士學位，師從李伯良研究員，2002年博士畢業。同年到美國德克薩斯大學西南醫學中心從事博士后研究工作，師從Michael S. Brown 、Joseph L. Goldstein和Russell DeBose-Boyd（Michael S. Brown 和Joseph L. Goldstein因發現LDLR及其跟膽固醇代謝與家族性膽固醇血症的關係而獲得1985年諾貝爾生理或醫學獎）。2005年回到中科院上海生物化學與細胞生物學研究所任PI，期間曾任分子生物學國家重點實驗室副主任（2012-2014），生化細胞所所長助理（2013-2014）。2014年始任武漢大學生命科學學院院長。宋老師實驗室主要從事與心腦血管疾病發生密切相關的膽固醇代謝平衡調控的研究。首次提出並證明了小腸細胞對飲食膽固醇吸收的分子模型，發現了該途徑中的多個蛋白因子（2014，Nature Medicine；2014，J Biol Chem；2011, PNAS; 2008，Cell Metabolism;）；深入探索了內源膽固醇合成的負反饋調控機制—HMGCR蛋白的受控降解(2007, Cell Metabolism；2005，Molecular Cell；2005，Cell Metabolism；2003，J Biol Chem)揭示了肝臟脂質合成與棕色脂肪能量代謝的聯繫（2012，Cell Metabolism）；構建了基於膽固醇合成負反饋調控途徑的篩選體系，並獲得了能同時降低膽固醇和甘油三酯的活性化合物白樺酯醇（2011，Cell Metabolism）。這些原創性成果不僅豐富了膽固醇代謝平衡調控的基礎理論，並且對研發新型的降脂藥物具有重要意義。最近宋老師課題組還在細胞內膽固醇動態運輸的分子機制方面獲得了突破性的研究成果（2015，Cell）。宋老師目前還擔任JBC雜誌編委和JMBC雜誌副主編，此外還曾獲得過談家楨生命科學創新獎（2014）、青年科技獎（2013）、亞太Arthur Kornberg Memorial Award（2013）、陳嘉庚青年科學獎（首屆，2012）等。主要研究方向包括：1）小腸膽固醇吸收的分子途徑；2）細胞內膽固醇動態運輸的分子機制；3）膽固醇代謝調控的信號轉導途徑和機理；4）膽固醇代謝的葯靶系統及新葯研發。實驗室的長期目標是揭示膽固醇代謝的分子機制，發展治療膽固醇相關疾病的新策略。

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