顯微鏡油鏡的使用及細菌的簡單染色法

顯微鏡油鏡的使用及細菌的簡單染色法

一、實驗目的：

1.學習並掌握普通光學顯微鏡油鏡的使用技術；

2.學習微生物製片、染色的基本技術，掌握細菌的

簡單染色法及無菌操作技術；

3.觀察細菌的基本形態。

二、實驗原理：

1、染色原理：用於生物染色的染料主要有鹼性染料、酸性

染料和中性染料三大類。鹼性染料的離子帶正電荷，能和

帶負電荷的物質結合。因細菌蛋白質等電點較低，當它生

長於中性、鹼性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷，所以通

常採用鹼性染料（如美藍、結晶紫、鹼性復紅或孔雀綠

等）使其著色。酸性染料的離子帶負電荷，能與帶正電荷

的物質結合。當細菌分解糖類產酸使培養基pH下降時，細

菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復紅或剛果紅等

酸性染料著色。中性染料是前兩者的結合物又稱複合染

料，如伊紅美藍、伊紅天青等。

簡單染色法:是只用一種染料使細菌著色以

顯示其形態的染色法，簡單染

色不能辨別細菌細胞的構造。

2、顯微鏡油鏡工作原理：

利用油鏡不但能增加照明度，更主要是能增加數值口

徑，因為顯微鏡的放大效能是由其數值口徑決定的。所

謂數值口徑，即光線投射到物鏡上的最大角度（稱為鏡

口角）的一半正弦，乘上玻片與物鏡間介質的折射率所

得的乘積，可用下列公式表示：

N•A=n•sinα

N•A:數值孔徑

n:介質折射率

α：鏡口角的半數

顯微鏡的解析度是指顯微鏡能夠辨別兩點之間最小距離的能力。它與接物鏡的數值口徑成正比，與光波長度成反比，因此接物鏡的數值口徑愈大，光波波長愈短，則顯微鏡的分辨力愈大，被檢物體的細微結構也愈能明顯地區別出來。

能辨別兩點之間最小距離= 1/2光波長度÷數值口徑

= 1/2λ÷N•A

三 、實驗器材

1、活材料：

培養18-24h的金黃色葡萄球菌

和芽孢桿菌。

2、染色液和試劑：

復紅、美蘭、二甲苯、香柏油。

3、器材：

載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡。

四、實驗步驟：

1、塗片：

取乾淨載玻片一塊，在載玻片的左、右各加一滴蒸餾

水，按無菌操作法取菌塗片，左邊塗金黃色葡萄球菌，右

邊塗芽孢桿菌，做成薄的塗面，注意取菌不要太多。

整個過程中要注意無菌操作。（示範無菌操作技術）

2、乾燥：讓塗片自然晾乾或者在酒精燈火焰上方文

火烘乾。

3、固定：手執玻片一端，讓菌膜朝上， 通過火焰

2-3次固定（以不燙手為宜）。

4、染色：將固定過的塗片加復紅或美蘭染色1-2min。

5、水洗：用水洗去塗片上的染色液。

6、乾燥：將洗過的塗片放在空氣中晾乾或用吸水紙吸干。

7、鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，並找出適當的視野

后，將高倍鏡轉出，在塗片上加香柏油一滴，將

油鏡頭浸入油滴中仔細調焦觀察細菌的形態。

8、繪圖：

9、實驗完畢后的處理：

①將浸過油的鏡頭按下述方法擦拭乾凈：

a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。

b.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦2—3次。

c.再用乾淨的擦鏡紙將鏡頭擦2—3次。注意擦鏡頭時向一個

方向擦拭。

②看后的染色玻片用廢紙將香柏油擦乾淨，再用洗衣粉清洗。

六、注意事項

1、油浸物鏡的工作距離（指物鏡前透鏡的表面到被檢物體

之間的距離）很短，一般在0.2mm以內，再加上一般

光學顯微鏡的油浸物鏡沒有「彈簧裝置」，因此使用油浸物

鏡時要特別細心，避免由於「調焦」不慎而壓碎標本片並使

物鏡受損。

2、染色過程中勿使染色液乾涸。用水沖洗后，應吸去玻片上

的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。

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