單細胞轉錄組測序詳解

在某一特定階段，由細胞轉錄出來的全部RNA稱之為轉錄組（transcriptome），其包括mRNA和非編碼RNA。準確深入地分析轉錄組，有助於全面理解細胞基因表達和調控網路的作用。相同組織的細胞基因型幾乎一致，但亞單位的表達往往不同，轉錄組更能反映甲基化和組蛋白等修飾的差異。不同組織的細胞各自擁有獨特的轉錄組，研究這些轉錄組能夠從不同的生理功能和表型角度闡釋基因調控網路。

一般轉錄組實驗常需要成千上萬甚至上百萬個細胞，然而了解控制人類胚胎髮育的基因調控網路所需的早期胚胎細胞和幹細胞等只能收集到微量細胞，這就要求實驗中利用儘可能少的細胞，最好是在單細胞水平進行轉錄組的分析。單細胞RNA測序(RNA-Seq)就是在單個細胞水平上對轉錄組進行擴增與測序的一項新技術。

單細胞轉錄組是指某個細胞在某一生理功能狀態下所有轉錄的mRNA產物的集合，是基因組遺傳信息傳遞和表達的重要步驟和過程。與參考基因組比較，可以得到基因表達差異、可變剪接、融合基因等遺傳調控信息。

技術路線：

技術優勢：

1、運用MALBAC技術進行轉錄組擴增；

2、無物種的限定，要求mRNA有Poly A尾巴結構；

3、解析度高：單鹼基解析度；

4、覆蓋度高：能覆蓋到幾乎所有轉錄本片段序列；

5、檢測範圍廣：從幾個到數十萬個拷貝精確計數，可同時鑒定及定量正常和稀有轉錄本。

樣品要求：

取樣要求：做好記錄、避免污染、充分取樣.

組織樣品必須是在手術切除后立即冷凍保存（液氮或-80℃），保存時間在一年之內；全血（或骨髓）樣品不少於5mL，需用抗凝采血管取樣和抗凝管分裝，並且在-80℃保存；

細胞懸液或細胞系，需按照細胞凍存的標準操作，使用細胞凍存液梯度降溫保存於液氮或-80℃；

分離的單細胞樣品推薦使用PH在7.2-7.4的1x PBS buffer (不含Ca2+和Mg2+) 加上1%的BSA細胞保存液保存，總體積不超過2µL，立刻液氮速凍，乾冰運輸。

對於腫瘤樣品所取樣品大小建議為1-2cm3（過大不利於樣品的凍存，過小則不能滿足取樣用量），對難取樣或珍貴的標本，樣品大小至少5mm3。

成功案例：

單細胞轉錄組測序繪製人類植入前胚胎和胚胎幹細胞轉錄組圖譜

通過對處於不同發育階段的早期胚胎的90個單細胞以及人類胚胎幹細胞系(hESCs)的34個單細胞進行了單細胞轉錄組測序，並開展詳盡的生物信息分析。

1） 構建了世界上最完整的人類胚胎髮育基因表達圖譜，檢測出了22,687個母源表達基因，其中包括8,701條長鏈非編碼RNAs（long noncoding RNAs，lncRNAs），相比於以往通過cDNA微陣列檢測出的9,735個母源基因數量大大增加。

2）在國際上首次成功地分離了囊胚階段胚胎中的三種細胞（上胚層細胞、原始內胚層細胞、以及滋養外胚層細胞），並進一步分析其基因表達情況，發現了一批新的細胞分化相關的標誌基因。

3）在人類植入前胚胎中發現了兩千七百多種全新的lncRNA，其中許多lncRNA表達具有發育階段特異性，很可能參與了植入前胚胎髮育過程中的細胞命運決定。

4） 通過將本研究採用的單細胞轉錄組分析技術與國際已經有商業化試劑盒的Smart-Seq單細胞轉錄組分析技術進行了系統比較，發現本研究組採用的技術在靈敏度、技術穩定性、以及cDNA的全長覆蓋均勻度等方面均明顯優於Smart-Seq技術。

參考文獻：

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