「功能」加"翻譯"型環狀RNA

導讀：義大利和德國科學家在最新一期的《Molecular Cell》發表了環狀RNA最新研究成果，在肌肉體外生成過程中科研人員通過RNA-seq和高通量表型篩選發現環狀RNA Circ-ZNF609調控成肌細胞的增殖，並提供強烈證據表明Circ-ZNF609能夠翻譯。

小編引言：功能性環狀RNA翻譯

《Molecular Cell》同一期連載兩篇環狀RNA翻譯文章，將環狀RNA翻譯的科學研究推向了熱點。

科學院－馬普學會計算生物學夥伴研究所研究員王澤峰在《細胞研究》（Cell Research）上在線發表了題為《Extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine》的研究論文，該研究發現了大量的環形RNA可作為信使RNA來編碼蛋白，這些環形信使RNA通過一種常見的RNA甲基化修飾m6A，來驅動非帽依賴性的翻譯機制來合成蛋白質。該研究進一步拓展了環裝RNA的功能，對蛋白質來源的多樣性有新的認識，具有十分重要的理論意義。

該文作者們進一步研究了環形RNA的翻譯機制，發現了m6A識別蛋白YTHDF3能夠結合到環狀RNA的修飾位點並募集eIF4G2和其他翻譯起始因子來驅動環狀RNA的翻譯。同時，他們通過多核糖體分析和RNA測序發現大量的環狀RNA與多核糖體結合在一起。在此基礎上，利用質譜分析的方法鑒定了一些由環狀RNA反向剪接介面編碼的新肽段。

因為環狀RNA 沒有5』端帽結構，所以所有的環狀RNA翻譯都是通過非 5』端帽依賴性翻譯進行的。因而環狀 RNA 可能通過產生刺激誘導蛋白在細胞應激反應中發揮重要作用。根據類似推理，環狀 RNA 編碼的蛋白可能在疾病發展過程中發揮重要作用。本文不贅述相關機制和理論，著重闡述功能性環狀篩選模式和環狀RNA翻譯蛋白研究技術思路。

研究思路

1.環狀RNA測序及其生物信息學分析

• 人和小鼠的成肌細胞 (表達MyoD和Myf5)

• 肌管細胞 (表達Myosin Heavy Chain ，MHC和 Muscle Creatin Kinase ，CKM)

通過RNA-seq尋找成肌細胞向成熟肌細胞分化、形成肌管過程中環狀RNA。

2.環狀RNA在人類成肌細胞分化和疾病中差異表達分析

3.基於RNAi的環狀RNA功能篩選

上述篩選得到了四種表徵的環狀RNA：

(1) 保守性（conservation）

(2)表達丰度（ ex pression level）

(3) 分化過程中調控（modulation during differentiation）

(4) 環化/線性比值（cir-cular/linear ratio）

基於上述特徵作者選擇了29個代表性環狀RNA利用RNAi技術進行功能篩選。

RNAi篩選原則（艾博思專業的設計團隊為您的環狀RNA設計助力）

(1) siRNA選擇環狀RNA頭尾結合處;

(2) 7-mer種子區不在線性宿主基因中;

(3) 種子區化學修飾減少類似miRNA的脫靶效應；

通過功能篩選發現一個重要的環狀RNACirc-ZNF609調控成肌細胞的增殖。

高通量RNAi方法進行環狀RNA篩選已經成為一種重要研究方法，小編提醒大家，趕緊行動起來，機不可失！

4.環狀RNA Circ-ZNF609具有蛋白編碼能力

環狀RNA翻譯蛋白研究技術思路

1.環狀RNA翻譯模型假設

2.環狀RNA翻譯模型證據

3.環狀RNA編碼潛能的預測工具

4.試驗手段驗證

1）環狀RNA的結構分析，分析環狀RNA是否具有翻譯蛋白的特徵。

環狀RNA翻譯蛋白需要兩個基本要素：翻譯啟動元件和閱讀框。

2）人為設計載體分析和驗證，針對所分析的環狀RNA基本特徵中關鍵位點進行突變驗證。

預測分析了環狀RNA可能具有翻譯蛋白的功能后首先需要通過構建載體進行驗證。這其中包括針對翻譯啟動元件是否發揮功能的驗證實驗和閱讀框翻譯產物的驗證實驗。元件突變實驗比較容易理解，就是把預測的IRES或m6A修飾位點給突變掉，看後續的翻譯活動是否還能順利進行。閱讀框更換實驗目前有兩種構建思路：

（1）在原有閱讀框的前端增加標籤序列，包括3×Flag等標籤。

（2）用報告基因替換原有閱讀框，包括熒光素酶報告基因或熒光蛋白報告基因等。

3）內源性翻譯多肽或蛋白的鑒定與功能分析，找到內源性環狀RNA翻譯多肽或蛋白的直接證據並進一步研究其功能。

環狀RNA沒有遊離的5'和3'端，因此如果可以進行翻譯活動有一定是5'-帽子非依賴的方式進行的。目前已報道的環狀RNA翻譯蛋白的調控元件包括IRES和m6A修飾兩種途徑。內源性的環狀RNA翻譯產物鑒定和功能研究是整個研究思路中最重要的部分。包括內源性翻譯產物鑒定，核糖體結合驗證，翻譯產物過表達和敲低（或敲除）實驗。

內源性翻譯產物鑒定：內源翻譯產物鑒定就是要證明在所研究的材料中天然存在預測的翻譯產物。目前這方面的研究思路首選是通過製備特異性的抗體進行Western等檢測實驗。這部分需要注意保證所製備的抗體的特異性，因此需要有抗體特異性的證明實驗，具體包括模擬翻譯產物的過表達和敲除實驗等等。得到了特異性高的抗體后，一方面可以通過Western實驗進行雜交實驗，還可以通過IP後進行質譜鑒定。質譜鑒定實驗需要提前製備化學合成的靶分子多肽獲得標準化圖譜，然後在IP產物的質譜分析中找出與標準化圖譜一致的肽段。

核糖體結合分析：是否有核糖體結合在環狀RNA上也是是否進行翻譯活動的重要實驗證據。目前已有比較成熟的基於蔗糖密度梯度離心的核糖體分離技術。在所獲得樣品中鑒定是否有我們感興趣的環狀RNA存在。一些工具葯有助於增加這個實驗的成功率，如嘌呤黴素。