幹細胞技術：一個潛在的創傷治療手段

2017年5月24日至28日期間，以「質量與學科」為主題的第11次全國重症醫學大會在十三朝古都西安順利召開，重症護理、ARDS50年、中美聯合論壇膿毒血症等13個分會場為全國的同道們帶來了一場饕餮的視聽盛宴。

作者丨張盛 台州市第一人民醫院急診科

來自奧地利國際休克協會聯合會主席Soheyl Bahrami教授帶來的關於「幹細胞技術在急診創傷中的潛在應用」報道讓人耳目一新。

什麼是幹細胞？幹細胞在急診創傷治療中到底扮演一個什麼樣的角色？下面就讓我們帶著這些問題進行深入的科學探索。

在現代發達的創傷救治系統中，及時的院前急救措施、快速的院內診斷以及基於大數據的個體化創傷病員復甦管理，使得創傷病人的死亡率和致殘率得到了有效的控制，但是機體組織損傷后的恢復水平仍然與病人內在的生物學和再生能力有關。受損后機體的生理功能有時候是無法治癒的，甚至會以大量的疤痕組織增生、創傷相關性免疫系統功能障礙等形式導致傷后多器官功能衰竭。創傷后最完美的治療就是能恢復到損傷前的功能狀態而不是形成嚴重瘢痕組織限制機體功能。目前的研究主要集中在如何調節病人體內的生理學來優化癒合的過程。幹細胞治療是實現這一目標的一個潛在的途徑。

幹細胞是一種多功能細胞，能夠再生人體的各種組織，因此在創傷治療中有一定的臨床潛力，特別是在骨折癒合、軟骨癒合及創傷后炎症等方面。迄今為止，研究主要集中在了解幹細胞的行為和功能，雖然有些轉化的應用已經達到了1期臨床試驗，但在幹細胞治療真正達到臨床實踐之前，還有許多問題等待解決。

1.幹細胞的生物學

身體里的再生細胞可以根據能力來進行分類，其中再生能力最強是全能型的胚泡細胞，然後是多功能幹細胞、祖細胞和前體細胞（如下圖所示），這些細胞具有內在的再生能力，當然這裡面也有與創傷相關的特殊幹細胞。幹細胞是未分化的細胞，從三個原始生殖層（內胚層、中胚層和外胚層）發展而來，具有自我更新和分化為各類成熟細胞的能力。幹細胞是在全身的某個局部微環境中被發現的，在這個環境中幹細胞處於未分化的休眠狀態。在幹細胞和鄰近細胞之間存在多種分子機制控制著其分化和自我保護。這裡主要介紹與創傷修復相關性的4種細胞：間質幹細胞（MSC），造血幹細胞（HSC），脂肪幹細胞（ADSC）和內皮祖細胞（EPC）。其中MSC和HSC大部分主要存在於骨髓內，EPC位於內皮細胞，而ADSC存儲於脂肪組織。值得注意的是，目前有新技術可以將收穫的體細胞轉化為誘導多能幹細胞（iPSC）並獲得潛在的再生能力。

間質幹細胞（MSC）是一種多功能的幹細胞，可以在中胚層內分化成任何非造血細胞，如成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和骨髓細胞。它們的特徵是細胞表面攜帶標誌物CD105、CD73和CD90。MSC可以在多個部位採集，包括肌肉、脂肪組織、骨髓和自體臍帶中，現有技術可以在體外進行篩選、培養和增殖以供在機體移植時使用。MSC是臨床試驗中研究最多的一類幹細胞，骨髓間質幹細胞由於缺乏MHC II類分子和協同刺激分子使得它們免疫原性削弱，與多功能胚胎幹細胞相比它們也不會導致畸胎瘤的形成，這些性質使得它們在自體和異體的臨床應用中更有吸引力。

造血幹細胞（HSC）能夠分化成為粒細胞或淋巴細胞，這些細胞的特徵是表面攜帶標誌物CD34、CD45、CD133和Thy1，它們能從骨髓及外周血中獲得，可在惡性腫瘤如白血病細胞、淋巴瘤和骨髓衰竭等同種異體移植中應用。

脂肪幹細胞（ADSC）由脂肪組織中獲得，與骨髓來源的間質幹細胞功能相似，這些細胞的特徵是表面攜帶標誌物CD90、CD73和CD44。

內皮祖細胞（EPC）具有血管生成的潛力，它們存在於外周循環中，表面攜帶標誌物CD34，Flk-1和Tie-2。

2.創傷對幹細胞的影響

創傷導致組織結構性破壞，使組織灌注受損，並誘發炎症反應。幹細胞對創傷的生理反應包括從它們的休眠狀態中蘇醒，從它們的原始居住場所中動員並向受傷的部位遷移，最後分化產生治療所需的特定細胞。此外，病理性的炎性反應不僅會導致幹細胞的功能失調，同時會使幹細胞的數量減少，最終將導致組織再生失敗或其他不良預后。

在創傷后MSC與HSC的遷移已被許多趨化作用闡明。其中一種信號途徑就是下圖所示的基質衍生因子1/特異性趨化因子受體4（SDF-1/CXCR4）軸。這條信號軸解釋了幹細胞在局部停留及向受傷部位遷移的過程。CXCR4是骨髓間質幹細胞的一種受體，它能結合SDF-1。SDF-1是一種由骨髓內皮細胞和基質細胞表達的蛋白質，繼受傷后，SDF-1在組織損傷的部位產生，其濃度高於骨髓，從而促進骨髓中MSC向受傷部位轉移。SDF-1的表達受缺氧誘導因子-1（HIF-1）和一氧化氮（NO）調控。在正常生理情況下，骨髓中的SDF-1濃度有利於保留骨髓間質幹細胞。這在動物骨折和心肌損傷模型中已被證實， CXCR4 受體的上調也使得間質幹細胞向SDF-1遷移得到進一步加強。

3.幹細胞在骨折癒合中的作用

骨在骨折后能夠再生和重建。AO基金會（(Arbeitsgemeinschaft für Osteosynthesefragen Foundation）總結了骨折治療的4個基本原則:骨折複位、骨折固定、血供的保護和早期安全的活動。基於這些原則的影響，在骨折后對血供的保護及術后早期的活動已經被證明對幹細胞生物學有一定的影響。血供對幹細胞遷移到損傷部位來說非常重要，而在受傷后的早期活動則提供了一種促進MSC分化的機械刺激。

骨折會引起骨髓內MSC的增生，骨折後會引起在骨髓和骨膜內的常駐幹細胞遷移至損傷部位。在骨折部位需要有一定數量的幹細胞進行修復，同時骨萎縮也被證實與骨折部位缺乏MSC有關。

充足的血供是幹細胞遷移並存活的必要條件。Atesok, K等發現在小鼠骨折後進行純化的EPC注射，有利於血管增生及更快的骨折癒合：在骨折部位EPC的血管生成效應與增加的親血管生成因子hVEGF、hFGF2和hHGF 44的局部水平相關；同時還發現MSC的遷移與增加的小鼠骨痂體積和強度有關聯。MSC約在EPC使用后第14天出現在骨折部位。這些治療效果與MSC遷移后局部BMP-21（骨形態生成蛋白）的表達有關。

幹細胞已被證明能對機械刺激產生反應。體外研究已經證實了幹細胞對以下刺激有反應，如牽拉、壓迫、剪切、震蕩、超聲波等。在拉伸、壓迫和超聲波等刺激下，幹細胞可表現出成骨分化。相反地，Dai等人發現，對小鼠的MSC進行反重力作用的試驗可抑制其成骨分化。有研究表明在體外試驗時，低強度脈衝超聲波可促進MSC的成骨轉化。

4.幹細胞在軟骨癒合中的作用

幹細胞的功能與關節軟骨損傷的恢復以及創傷后骨關節炎有關。在損傷的發生后，關節軟骨中的MSC會分化成纖維細胞，而不是軟骨細胞。這一過程的部分原因是ADAMTS5蛋白質介導的 TGFβ-1傳導途徑。ADAMTS5是一種軟骨聚蛋白多糖酶，創傷能誘導成纖維細胞內的ADAMTS5合成增加。而ADAMTS5能促使MSC分化成纖維細胞，而不是軟骨細胞。研究發現與對照組相比，在ADAMTS5蛋白移除的小鼠中，創傷時關節組織纖維化的情況更少，由此表明創傷可引起幹細胞分化的變化，並與創傷后骨性關節炎息息相關。

通過幹細胞在關節內注射能改善創傷引起的軟骨缺損。研究發現在小鼠模型中進行皮下注射幹細胞對軟骨癒合沒有影響。liu等人已經開發出一種不同的治療軟骨缺損的方法：通過在骨關節炎患者身上產生的軟骨組織移植來治療軟骨缺損：使用TGF-β3 和 BMP-6進行幹細胞培養，在6周后利用直徑超過2厘米的軟骨進行移植。Saw等在50名軟骨損傷的病人中進行了一項臨床試驗：50名患者隨機分組，治療組接受來自血液或透明質酸的自體幹細胞，對照組僅接受透明質酸治療。每一位病人都行關節鏡下的軟骨鑽孔及軟骨成形術，然後進行為期5周的膝關節注射並在第18個月行關節鏡檢查活檢。組織學分析及核磁共振檢查顯示，與對照組相比，治療組幹細胞的軟骨再生能力有所提高，但是關節功能評分並無差別。Oroszco等使用骨髓內分離的MSC來治療50名膝骨關節炎患者，結果發現疼痛和功能評分得到了顯著改善。Vangsness等人研究了關節鏡下半月板切除術后的關節內注射MSC的效果，結果發現半月板組織再生增加，伴有骨關節炎患者的疼痛評分得到改善，且在隨後的兩年隨訪中沒有出現嚴重的不良反應。

由此可見，使用MSC的治療方法有望能夠改善骨關節炎和創傷后的軟骨缺損。目前研究的重點是確定最佳的MSC來源、如何在植入前進行體外改造及更安全地使用。關於骨關節炎治療的已有多篇文獻得出肯定的結論，只不過在臨床應用前仍需要進行更多的研究。雖然MSC在骨關節炎和創傷后關節炎的治療目的都是重新生成透明軟骨，但這兩種病理的微環境各不相同，目前還不清楚對於骨關節炎的治療方法是否也同樣能有效地治療創傷后關節炎。

5. 幹細胞在外傷后炎症反應中的影響及在多臟器功能衰竭中的應用

損傷后的多臟器功能不全一直被認為是由對創傷的過度炎症反應所引起。幹細胞具有免疫調節功能，MSC可以轉化為促炎症和抗炎細胞，它主要依賴於在創傷后炎症反應中分泌的介質如Toll樣受體(TLR)。TLR是一種表面受體，它能結合病原體分子和損傷相關模式分子 (一類由創傷后細胞破壞釋放的內源性產物，包括線粒體DNA(mtDNA)，高機動性的編組框-1蛋白質和S100蛋白質等，具有激活免疫細胞的能力)，在調控炎症反應中起著重要的作用。

創傷后引起的中性粒細胞和巨噬細胞激活會對幹細胞造成損傷。在機體受傷后，中性粒細胞和幹細胞一起遷移到受傷的部位，但它們遷移到創傷部位的時間點不同。中性粒細胞被激活後會釋放活性氧，無意中損害了周圍的細胞包括幹細胞。如果損傷足夠嚴重，中性粒細胞的激活狀態持續存在(尤其是在細胞凋亡之後)，那麼幹細胞就可能會被破壞。動物實驗中發現，在腦損傷小鼠模型的急性炎症反應期內，活化的巨噬細胞直接吞噬了外源性幹細胞。此外，Molcanyi等人也證實，創傷引發了巨噬細胞的激活，而非那些具有免疫活性的幹細胞。

嚴重的創傷後會導致骨髓衰竭，創傷后高炎症反應狀態和G-CSF（粒細胞集落刺激因子）濃度升高將導致骨髓幹細胞造血功能受損，並容易引發感染。在動物實驗中發現通過MSC治療能逆轉骨髓損傷。Gore等人比較了兩種小鼠模型來研究同種異體骨髓細胞損傷后的治療效果，結果發現經過MSC治療后骨髓細胞計數和功能恢復到正常，同時血漿中的G-CSF 濃度也恢復正常。

嚴重創傷后經常會合併急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。Hayes等人在呼吸機引起的肺損傷小鼠模型中發現，使用人MSC進行靜脈內注射后，小鼠的肺順應性得到了提高，同時肺實質損傷得到改善，MSC還能減少炎症介質的釋放及肺泡內炎症滲出；Maron-Gutierrez 等在研究脂多糖(LPS)誘發的肺損傷小鼠模型中發現，人類MSC除了減少了炎症反應和肺不張外，同時還調節了巨噬細胞的抗炎功能。Wilson等人進行了一項I期臨床試驗，以確定MSC的安全性，試驗在9名中度至重度的ARDS患者中注射同種異體的MSC，結果沒有報道相關的副作用，但在隨後的II期研究中發現死亡率高達22%，與中度至重度ARDS患者的死亡率相似。

對於創傷修復來說，恢復良好的血供是治療的關鍵。創傷可導致急性和遲發性的毛細血管損傷，包括直接傷害、血管閉塞或因外科手術治療創傷時所造成的醫源性損傷。在受傷后，幹細胞對血管生成有直接和間接的影響。一些研究表明，ESC遷移到受傷的部位后直接參与了新生血管的形成。其他的研究也已經證實ESC通過生長因子、細胞因子的調節促進新生血管生成。MSC和ADSC也有促進血管生成的類似作用。這些幹細胞的血管生成功能最終有助於改善骨折的癒合、毛細血管再生、傷口的康復及減少炎症併發症。

目前，在國外儘管臨床試驗註冊中心進行了大量的1、2和3期臨床試驗，但仍然缺乏公開的臨床試驗。關於幹細胞治療在骨折癒合方面的研究，從文獻檢索中獲得的最高水平是2個二級的研究以及大量的動物研究和基礎研究。儘管幹細胞療法在通過組織再生和免疫調節治療創傷后，對改善患者預後有很大的幫助，但目前的文獻顯示結果還是不一致的。在幹細胞治療臨床應用之前，還需要克服許多困難。在動物模型和臨床試驗中仍需要進一步的研究來描述幹細胞在組織修復上的作用機制。此外，這些潛在的治療方法是否會導致功能改善和副作用也有待觀察。

參考文獻

[1]Thurairajah K, Broadhead ML, Balogh ZJ. Trauma and Stem Cells: Biology and Potential Therapeutic Implications. Int J Mol Sci. 2017. 18(3).

[2]Atesok K, Li R, Stewart DJ, Schemitsch EH. Endothelial progenitor cells promote fracture healing in a segmental bone defect model. J Orthop Res. 2010. 28(8): 1007-14.

[3]Dai ZQ, Wang R, Ling SK, Wan YM, Li YH. Simulated microgravity inhibits the proliferation and osteogenesis of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Cell Prolif. 2007. 40(5): 671-84.

[4]Kusuyama J, Bandow K, Shamoto M, Kakimoto K, Ohnishi T, Matsuguchi T. Low intensity pulsed ultrasound (LIPUS) influences the multilineage differentiation of mesenchymal stem and progenitor cell lines through ROCK-Cot/Tpl2-MEK-ERK signaling pathway. J Biol Chem. 2014. 289(15): 10330-44.

[5]Orozco L, Munar A, Soler R, et al. Treatment of knee osteoarthritis with autologous mesenchymal stem cells: two-year follow-up results. Transplantation. 2014. 97(11): e66-